所屬技術領域

本發明涉及一種利用脂質體法將外源基因高效轉染哺乳動物多潛能干細胞以及快速篩選轉基因多潛能干細胞克隆的方法。

背景技術

目前，公知的利用脂質體法構建轉基因細胞已經在科研、生產中廣泛應用。但是，外源基因轉染的受體細胞多為成體細胞而非多潛能干細胞。因而，利用公知的脂質體法操作規程轉染哺乳動物多潛能干細胞會出現外源基因瞬時轉染效率低，同時利用公知的轉基因細胞篩選程序會造成轉基因多潛能干細胞易發生分化、衰亡而導致外源基因轉染失敗。

發明內容

為了克服現有的脂質體法操作規程以及轉基因細胞克隆篩選不適用于哺乳動物多潛能干細胞的不足，本發明提供一種利用脂質體法高效轉染哺乳動物多潛能干細胞以及快速篩選轉基因多潛能干細胞的方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

1外源基因高效轉染哺乳動物多潛能干細胞

采用脂質體法，在外源基因轉染哺乳動物多潛能干細胞6小時后，用分別含有5％、15％胎牛血清的干細胞培養液培養36小時，而后換為15％胎牛血清的干細胞培養液。流式細胞儀對比檢測外源基因的瞬時轉染效率。

2轉基因多潛能干細胞快速篩選

由于外源基因通常攜帶有Neor(neomycin?resistance)新霉素抗性基因，可以通過一定濃度的G418抗生素殺死非轉基因多潛能干細胞，從而篩選、純化轉基因多潛能干細胞。外源基因轉染哺乳動物多潛能干細胞36小時后，以含有500μg/mL?G418的干細胞培養液培養20小時，然后再以含有6mg/mL?G418的干細胞培養液培養5小時。連續傳2代，可獲得純化的轉基因多潛能干細胞克隆。

本發明的有益效果是，外源基因的瞬時轉染效率由23.3％提高至69.17％，篩選周期由14天減少至25小時。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。

圖1是脂質體法介導的p?CMV-DsRed轉染哺乳動物綿羊羊水來源多潛能干細胞36小時后的流式細胞儀分析(a轉染6小時后換為培養液II的綿羊羊水來源多潛能干細胞的外源基因瞬時轉染率為23.3％，b轉染6小時后換為培養液III的綿羊羊水來源多潛能干細胞的外源基因瞬時轉染率為69.17％)。

圖2是6mg/mLG418篩選純化轉基因綿羊羊水來源多潛能干細胞(a為對照細胞的篩選(200×)，b為篩選純化的轉基因AFSC克隆(200×))。

圖3是RT-PCR分析轉基因綿羊羊水來源多潛能干細胞標志基因表達情況(M為DL2000DNAmarker，1為Oct42為SSEA-1，3為MHC-II，4為GAPDH)。

圖4轉基因綿羊羊水來源多潛能干細胞懸浮培養7天后形成的類胚體(a為普通光源下的類胚體(600×)，b為紫外光激發下的類胚體(600×))。

具體實施方式

首先，配制綿羊羊水來源多潛能干細胞培養液：培養液I：DMEM+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸鈉+微量β-巰基乙醇+5ng或500u/mL?LIF+5ng/mLbFGF；培養液II：培養液I+15％FBS；培養液III：培養液I+5％FBS，用0.22μL的濾器過濾，4℃保存。

圖1中a、b外源基因的瞬時轉染率獲得的具體步驟為：

參照Lipofectamine?LTX?and?PLUS?Reagents試劑盒(TAKARA)說明進行，主要步驟為，轉染24h前，待轉染AFSC干細胞胰酶消化重懸細胞，以5×10⁴細胞/孔密度接種2×24孔板，使用培養液II，待細胞80％匯合度時，進行轉染；轉染前，AFSC用D-PBS洗三遍，換為Opti-MEM培養液于37℃5％CO₂飽和濕度條件下培養30～40min；質粒DNA(350ng/μL)2μL+100μL?Opti-MEM+0.7μL?Plus，室溫靜置5min；添加2uL?LTX，混均，室溫靜置30min后滴加入待轉染的孔中，37℃5％CO₂飽和濕度條件下培養4～6h后，其中一24孔板換為培養液III，另一24孔板換為培養液II。36h后換培養液II。同時，0.25％胰酶消化收集細胞，分別以未轉染的AFSC為陰性對照，流式細胞儀測定基因轉染的瞬時轉染效率。(注：AFSC為羊水來源多潛能干細胞的英文縮寫)

圖2中a、b獲得的具體步驟為