技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥及體外診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及檢測尿液樣本中前列腺癌組織表達基因PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PCR法及其診斷試劑盒。?

背景技術(shù)

前列腺癌(prostate?carcinoma，PCa)是男性常見的惡性腫瘤之一，除少數(shù)病例外；其生長大多比較緩慢，潛伏期較長，有些甚至終生不被發(fā)現(xiàn)。許多患者早期沒有任何主觀不適，等出現(xiàn)臨床癥狀時已至疾病晚期，從而錯過了最佳治療時機。臨床上探尋前列腺癌的早期診斷方法，一直是研究的熱點。因此，開發(fā)早期診斷前列腺癌的試劑盒有重要的臨床價值。目前血清前列腺特異性抗原(PSA)是臨床應(yīng)用最廣泛的前列腺腫瘤標(biāo)記物，PSA敏感度高，但特異度較低，由此導(dǎo)致臨床前列腺穿刺活檢陰性幾率較高，以及多次前列腺重復(fù)穿刺活檢、過度診斷和過度醫(yī)療等問題。因此人們不斷尋找敏感性高，特異性強的檢測項目。?

PCA3(prostate?cancer?antigen3)是1999年Bussemakers等應(yīng)用差異顯示分析方法，通過比較前列腺癌組織和正常前列腺組織的mRNA表達譜時發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異性基因。PCA3基因位于9號染色體長臂2區(qū)1帶到2帶，全長25000bp，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，具有很高的組織特異性和癌特異性，在癌變的前列腺細胞中表達量很高，具有較高的敏感性和特異性，是最新發(fā)現(xiàn)的前列腺癌早期診斷篩查和對治療后的患者進行有效的監(jiān)測的標(biāo)記物。Hessels等應(yīng)用RT-PCR法證實，PCA3基因高度表達于前列腺癌組織，在正常前列腺、良性前列腺增生細胞中僅有少數(shù)表達或不表達，在其他腫瘤組織及器官中無表?達，現(xiàn)已成為一種較有應(yīng)用前景的前列腺癌標(biāo)記物，它較之單一檢測PSA水平篩查前列腺癌具有更高的效能。?

各種研究認為PCA3基因序列中含有高密度的終止密碼子，因而PCA3表達非編碼的mRNA，而不產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)。因此，目前檢測PCA3的主要方法都是檢測PCA3?mRNA。研究還發(fā)現(xiàn)PCa組中PCA3?mRNA和PSA?mRNA含量顯著高于前列腺增生組，PCA3?mRNA和PSA?mRNA可作為PCa診斷的良好標(biāo)志。PSA?mRNA診斷PCa的敏感度高于PCA3?mRNA，但特異度較之低，可能是由于PSA?mRNA在腫瘤細胞中的表達量高于PCA3?mRNA，而PCA3?mRNA高度特異性地表達于PCa細胞。因此，若將PCA3?mRNA和PSA?mRNA聯(lián)合檢測，則可相互彌補PCA3?mRNA敏感度低和PSA?mRNA特異性低的不足，從而大大提高對早期PCa的診斷效能。臨床評估證明PCA3在前列腺癌的診斷過程中能與PSA檢測結(jié)合，有效排除前列腺體積、炎癥等干擾因素，顯著提高前列腺癌的早期診斷價值。PCA3分?jǐn)?shù)＝PCA3?mRNA表達量/PSA?mRNA表達量。慢性前列腺炎、前列腺體積、PSA水平對PCA3分?jǐn)?shù)沒有影響。在世界多個地區(qū)、國家的人群多樣本研究中表明，PCA3分?jǐn)?shù)可以有效預(yù)測穿刺陽性活檢率。?

目前有3種針對PCA3的診斷技術(shù)，第一種是以熒光定量PCR技術(shù)定量檢測PCA3?mRNA的表達；第二種是uPM3技術(shù)，是由Bostwick實驗室發(fā)展的基于核苷酸序列擴增的檢驗方法；第三種是Gen-Probe公司以APTIMA技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)分子診斷試劑盒，為目前唯一的商業(yè)化試劑盒。國內(nèi)外各種研究表明，利用熒光定量RT-PCR建立的PCA3評分方法，方法簡便、特異且重復(fù)性好，為臨床應(yīng)用提供了一種新方法。?

本發(fā)明應(yīng)用Taqman熒光探針技術(shù)定量檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因的mRNA的表達，然后通過對比兩種基因的表達，建立PCA3評分標(biāo)準(zhǔn)，PCA3分?數(shù)可以協(xié)助臨床醫(yī)生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預(yù)測前列腺穿刺陽性活檢率。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的提供一種可以同時對尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量定量檢測體外診斷試劑盒。?

本發(fā)明的另一目的在于建立一種對尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量熒光定量PCR檢測方法，通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標(biāo)準(zhǔn)，PCA3分?jǐn)?shù)可以協(xié)助臨床醫(yī)生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預(yù)測前列腺穿刺陽性活檢率。?

所述的PCA3/PSA?mRNA熒光定量PCR檢測試劑盒包括PCA3/PSA-PCR反應(yīng)液、PCA3/PSA?RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA?RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品。?