技術領域

本發明屬于蛋白質工程和基因工程領域，涉及一類強分泌性信號肽增強小肽模序及其應用。

背景技術

蛋白質的分泌系統不僅是蛋白質分選、定位和實現生理功能的前提，更是基因工程及蛋白質工程技術開發的重要手段。人們已經研究出多種原核和真核表達系統用以生產重組蛋白。大腸桿菌表達系統以其遺傳背景清楚、操作簡單、能在廉價培養基中迅速生長及易于大規模發酵培養等特點而備受關注；目前大腸桿菌體系已用于制備多種酶制劑，甚至一些藥用蛋白質，如干擾素、胰島素和人血清蛋白等，在生物技術領域取得了令人矚目的成果。

在大腸桿菌中，重組蛋白在原則上可以被以下幾種方式生產：1、可溶性蛋白胞內生產；2、包涵體胞內生產；3、分泌至周質空間或胞外培養基中。大腸桿菌體系適合于生產翻譯后無需修飾加工的蛋白質，且由于大腸桿菌缺乏蛋白折疊過程中需要的輔助因子，往往使中間體大量積聚，易形成包涵體沉淀，還須經過復性等繁瑣過程；而周質氧化型的氧化還原環境有利于蛋白質的折疊。如果蛋白質跨過細胞的內膜定位于周質空間，甚至穿過細胞外膜直接分泌至胞外培養基中，可以極大簡化下游復性及分離純化工藝，減少表達蛋白對宿主菌的毒性和代謝負擔，顯著提高表達量。

現有的分泌表達體系大多數是分泌到周質空間，獲取重組蛋白仍然需要細胞破碎和純化。少數分泌到胞外的則由于大腸桿菌本身的蛋白質分泌系統不夠完善，或人類對其分泌系統認識的局限性，導致了分泌效率極低及融合蛋白的后加工問題。

信號肽是一類10-60個氨基酸左右的多肽，一般位于分泌蛋白的N端。利用信號肽分泌表達蛋白，一般操作方法是將目的蛋白的編碼基因克隆到信號肽序列后端，在宿主中實現目的基因和信號肽序列在轉錄和翻譯水平的融合，依靠蛋白質前體N端信號肽引導整個多肽鏈與胞內分子伴侶或分泌信號識別顆粒的結合、膜定位或分泌出胞外。

盡管胞外分泌表達策略相比其他表達方式有著顯著的優勢，但是目前在大腸桿菌體系中廣泛運用此種策略仍有諸多限制。因此，擁有能夠攜帶目的蛋白分泌出胞外的信號肽是先決條件，并且即使信號肽具有介導蛋白胞外分泌的能力，也并不表明特定的信號肽對所有的重組蛋白具有這種介導能力或者具有同樣水平的介導能力。每個重組蛋白具有自己特定的編碼基因，信號肽和重組蛋白的過渡點序列不同，而且重組蛋白自身的結構也有差異，因而重組蛋白的分泌水平取決于其信號肽的最優化水平、目標蛋白有利的跨膜結構以及它們之間的匹配度水平。

大腸桿菌表達系統中，分泌蛋白穿越質膜的基本分泌途徑以Sec或Tat這兩種系統為主，例如外膜蛋白（OmpA）信號肽、果膠酸脂裂解酶（PelB）信號肽通過Sec途徑，三甲胺N氧化物還原酶（TorA）信號肽通過Tat途徑，這兩種類型的信號肽都有成功運用于分泌表達外源蛋白的案例。

發明內容

本發明的技術目的在于提供一種具有增強信號肽分泌效率的功能的強分泌性信號肽增強小肽模序，使得通過在諸如ompA信號肽或pelB信號肽前端融合添加本發明的小肽模序，可以實現上述信號肽在大腸桿菌體系中的分泌表達外源蛋白的能力。

本發明的另一個技術目的在于提供上述具有增強信號肽分泌效率的功能的強分泌信號肽增強小肽模序的應用，即將此小肽模序用于構建一種增強普通信號肽分泌能力的載體，以提高其分泌表達外源蛋白的方法。

本發明中的術語“分泌”，是指蛋白質或肽的分子被轉運到細菌細胞的外部，而且它也包括這樣的情況：其中蛋白質或肽分子最終以完全游離的形式置于培養基中，以及其中部分蛋白質處在細菌外部或部分蛋白質存在于細菌的周質空間。

本發明中使用的下列術語除非特別說明具有如下的含義：

蛋白質氨基酸或多核苷酸的“變體”是指具有一個或多個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述“改變”可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有保守性改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可以具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。

“缺失”是指氨基酸序列或核苷酸序列中的一個或多個氨基酸或核苷酸的缺失?！安迦搿被颉疤砑印笔侵赴被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄械母淖儗е屡c原先分子相比，一個或多個氨基酸或核苷酸的增加?！疤鎿Q”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個或多個氨基酸或核苷酸。

為了實現本發明的技術目的，本發明的技術方案如下：