技術領域

本發明涉及檢測HIV-1蛋白酶抑制劑耐藥突變的方法及其試劑盒。

背景技術

一、蛋白酶抑制劑類藥物及其作用機制

獲得性免疫缺陷綜合癥（Acquired?Immune?Deficiency?Syndrome，AIDS），又稱艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原體為HIV-1（Human?Immunodeficiency?Virus，HIV），HIV屬于逆轉錄病毒，分為HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地區的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。

蛋白酶（Protease）對于HIV-1病毒中gag，gag-pol多聚蛋白和翻譯后加工、形成病毒核心的結構蛋白以及其他基本的酶類，都是十分必要的。HIV-1病毒進入血液后，病毒表面的包膜蛋白gp120和CD₄^＋T淋巴細胞表面的CD4受體結合，在gp41透膜蛋白的作用下，侵入細胞并脫殼。蛋白酶抑制劑（Protease?Inhibitors,PIs）主要以氫鍵方式與HIV-1病毒蛋白酶的Asp25、GLy27、Asp29殘基相互作用，與蛋白酶活性中的氨基酸殘基形成立體相互作用，使病毒蛋白的長鏈不能裂開，從而抑制蛋白酶的活性，致使HIV在被感染的細胞中產生不成熟的、不具有感染性的病毒顆粒，從而達到使病毒不能正常裝配，抑制HIV目的。

自1994年肽底物類似物蛋白酶抑制劑問世以來，截至目前，經美國FDA批準上市的此類抑制劑已有10種，其中洛匹那韋(Iopinavir/r，LPV)、阿扎那韋(atazanavir/r，ATv)、福沙普利那韋(fosamprenavir/r)和沙奎那韋(saquinavir/r，SQV)用于一線治療，替拉那韋(fipranavir/r)和大諾那韋(darunavir/r)用于挽救治療。這類藥物能迅速降低血漿中HIV-1病毒載量，療效突出，蛋白酶抑制劑已成為AIDS聯合用藥方案的重要組成部分，同時在補救治療（Salvage?therapy）中亦發揮重要作用。

二、HIV-1病毒蛋白酶抑制劑耐藥類型及機制

HIV蛋白酶是一個具有底物結合腔，呈中心對稱的同型二聚體，在特定位點剪切大分子多肽前體，釋放裝配感染性病毒顆粒所必須的結構蛋白和酶。當缺少這些功能蛋白酶時，則只能生成沒有感染能力的不成熟病毒顆粒。蛋白酶抑制劑對HIV蛋白酶活性位點均具強親和力，可抑制酶的催化活性。蛋白酶抑制劑發生耐藥的機制是HIV蛋白酶底物結合域或其遠端位點的氨基酸置換，直接或間接修改了PIs與酶接觸位點的數量和性質，進而降低PIs與酶的親和力。

迄今已發現與Pls耐藥相關的HIV-1突變有60多個，主要的耐藥位點有23、30、32、47、48、50、82和84；位于邊緣的46、54位點；位于酶內部的76、88和90。24、33、53和73位突變經常出現，這些位點對不同的Pls有不同的影響。L231、D30N、M46WL、G48V/M、184V、N88D/S和L90M突變會降低對奈非那韋(nelfinavlr，NFV)的敏感性；I50L、N88S和184V降低對ATV的敏感性；G48V/M、184V和L90M降低對SQV的敏感性；V32I、147V/A、154L/M和184V降低對fosamprenavir/r的敏感性；V47A降低對LPV的敏感性；V82L/T與tipranavir/r耐藥有關。有些突變可以增加一種或多種PIs的敏感性：I50L可以增加所有PIs的敏感性；I50V和154L可增加tipranavir敏感性；N88S可增加fosamprensvir敏感性；L76V可增加A1rv、SQV和fipranavir的敏感性。PI類耐藥突變發生比較慢，多個位點突變才產生完全耐藥，交叉耐藥比較少見，耐藥突變具有藥物特異性。例如，D30N位點突變與NFV有關，150V突變與APV有關，G48V和L90M突變與SQV有關，I50L突變與ATV相關。然而，蛋白酶其他位點，如編碼區82、84、90位點突變將產生交叉耐藥。

三、HIV-1的耐藥檢測方法

目前HIV-1病毒耐藥性檢測有兩種方法，即表型檢測及基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養進行，而基因型檢測則通過分子生物學方法檢測與耐藥性相關的病毒基因突變。