技術領域

本發明屬于DNA光修復酶制備領域，特別涉及一種環丁烷嘧啶二聚體光修復酶脂質體的制備方法。

背景技術

環丁烷嘧啶二聚體光修復酶(cuclobutane?pyrimidine?dimmer?photolyase，CPDase)是生物體利用光修復DNA損傷的主要工具。CPDase廣泛分布在各種物種之中，是一種分子量在55-65kD間的單體蛋白，人體內尚未發現CPDase。目前在全球范圍內，隨著環境破壞與紫外線到達地面的劑量與強度的增加，皮膚病尤其是皮膚癌的發病率逐年上升，原因是太陽光中的紫外線會對生物體內的大分子造成傷害，使DNA產生環丁烷嘧啶二聚體(cuclobutane?pyrimidine?dimmer，CPD)等光產物。CPD損傷在人體中很難被NER途徑等DNA損傷修復系統修復，這勢必會使常常暴露于日光下的人群中出現CPD光產物的積累，該損傷的積累將會影響DNA的復制與轉錄，造成免疫抑制及紅斑的產生，長期大量的積累會造成DNA的突變，進而造成癌變，而CPDase可有效清除紫外線照射細胞形成的CPD光產物，在防止紫外線損傷方面具有良好的效果。

目前，關于CPDase的制備方法國內外有相關專利和文獻進行報道。國外已有文獻報道不同來源CPDase的制備方法，包括基因克隆、蛋白質表達、純化制備，這些CPDase純化制備方法，主要采用傳統的蛋白質純化方法，即利用該蛋白質的溶解度、等電點、帶電荷數、疏水性等理化特征進行分步純化。美國《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.1984，259，6028-6032)報道，在制備大腸桿菌的CPDase時，采用基因克隆方法，將大腸桿菌CPDase基因構建到重組質粒，并使該重組質粒能在表達菌株中過量表達；收集、破碎表達后的菌體，離心收集的可溶上清液用硫酸銨沉淀，隨后依次用苯基-瓊脂糖柱層析、羥基磷灰石柱層析、二乙氨乙基-瓊脂糖柱層析、DNA-纖維素柱層析和苯基-瓊脂糖柱層析進行分步純化。據美國《突變研究》(Mutation?Research，1996，33，97-104)報道，在純化果蠅CPDase時，構建一種CPDase基因重組質粒，重組質粒轉化大腸桿菌后，在表達菌株中過量表達，菌液經破碎、離心后，取可溶性上清液經硫酸銨沉淀蛋白質，隨后經過藍色-瓊脂糖柱層析和DNA-纖維素柱層析進行兩步親和層析純化蛋白質；但藍色-瓊脂糖和DNA-纖維素柱基質價格非常昂貴，在分離過程中也會存在一些非特異性吸附蛋白質的影響。因此，上述的純化方法雖然能得到很純的樣品，但其純化步驟繁雜，純化周期長，因純化過程中要多次更換層析柱，使樣品處理過程復雜、蛋白質回收率低，使用的原理昂貴，不適合規模化批量制備蛋白質。最為重要的是，制備的CPDase不能穿透細胞膜或者皮膚的屏障進入細胞，從而導致DNA損傷修復效果不明顯。

另外，特異性高的親和層析方法是蛋白質制備的重要手段，發明專利200310106550.3中描述CPDase的親和制備，包括擴增CPDase基因，構建到帶有組氨酸-標簽的載體質粒中；過量表達CPDase，離心收集菌液，高壓破碎菌體，將離心分離出的上清液加入已結合鎳離子并用含0.005-0.05mol/l咪唑的緩沖液平衡過的鎳離子親和層析柱內，用含0.005-0.05mol/l咪唑的緩沖液洗去不能結合或非特異性結合的雜蛋白，再用含0.5-1.0mol/l咪唑的緩沖液或者鎳離子螯合劑洗脫，收集洗脫樣品，透析，冷凍干燥，即得到CPDase。這種方法制備的CPDase含有外源組氨酸標簽，這種標簽可能會對CPDase的正常結構和功能造成影響，并對后續的應用帶來潛在的安全隱患。國外在采用特異性高的親和層析方法純化另一種光修復酶時，對引入的外源標簽進行去除。據美國《生物化學雜志》(J.Bio.Chem1997，272，32591-32598)報道，在純化非洲爪蛙屬(6-4)光修復酶時，是將基因重組構建到一個含谷胱甘肽-S-轉移酶基因的重組質粒中，在表達菌株中過量表達，其蛋白質表達的產物為羧基端帶有谷胱甘肽-S-轉移酶的融合蛋白質，通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析柱一步純化得到很純的融合蛋白質，然后用凝血酶切除谷胱甘肽-S-轉移酶，最后利用DNA親和柱純化。這種方法利用的DNA親和柱價格昂貴，而且條件不容易控制，不利于該蛋白質規模化生產。這些方法制備的CPDase同樣不能穿透細胞膜或者皮膚的屏障進入細胞，從而導致DNA損傷修復效果不明顯。

發明內容