技術領域

本發明屬于鏈霉菌代謝工程技術領域，更具體地，本發明涉及一種基于代謝調控高產土霉素的新工藝。

背景技術

鏈霉菌是抗生素的主要生產菌株，目前很多鏈霉菌的基因組已經完成測序，通過基因序列的同源性比對，很多功能基因(調控因子)被發現，并在體外和體內進行了鑒定，很多調控因子與抗生素合成相關，通過調控抗生素合成途徑中的相關基因的表達量，從而提高抗生素的產量。這為進一步利用這些調控因子作為靶點進行基因改造，獲得抗生素高產突變菌株提供了便利。

龜裂鏈霉菌(Streptomyces?rimosus)作為工業用于生產四環素類抗生素的生產菌株，也是土霉素的主要生產菌株。土霉素(Oxytetracycline，OTC)是一種臨床上廣泛應用的廣譜抗生素，由Finlay等人于1950年首次報道在Streptomycesrimosus中發現。目前報道的OTC生產菌還有：Streptomyces?capuensis，Streptomyces?henetus和Streptomyces?platensis等。OTC對革蘭氏陽性、陰性細菌，螺旋菌，立克次體以及一些病毒具有抗菌性，通過可逆地結合到30S核糖體亞基上，阻止氨酰tRNA核糖體復合體的形成，從而達到抑菌的效果。然而，為了提高土霉素的產量，本領域還有必要進一步研究提高土霉素產量的方法。

區別于傳統菌種選育的方法，基因水平操作具有快速、有效獲得定點突變株的優勢。提高基因組中抗生素合成途徑相關基因的拷貝數來提高抗生素的產量的方法盡管已在現有技術中被應用，但提高合成途徑中哪個或哪些基因的拷貝有作用是不確定的，基因的選擇難度很大。并且很多現有研究顯示，提高基因的拷貝數不能保證基因的表達水平隨著拷貝數的增加而增加，由于菌株本身存在自我調節作用，很多情況下即使提高基因拷貝數也不能改變基因表達水平，不能進一步提高抗生素的合成。提高基因拷貝數是否有作用還取決于基因本身的特性，很多基因并不能藉由提高拷貝數來增加表達。因此，為了提高土霉素的產量，需要對土霉素合成途徑中相關基因進行篩選，以定位到關鍵性的，可有效實現調控的基因。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于代謝調控高產土霉素的新工藝。

在本發明的第一方面，提供一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產量的方法，所述方法包括：在龜裂鏈霉菌基因組中增加1-8個拷貝(如2、3、4、5、6、7個拷貝)的rgC基因。

在一個優選例中，所述方法還包括：在龜裂鏈霉菌基因組中增加1-8個拷貝(如2、3、4、5、6、7個拷貝)的otrC。

在另一優選例中，所述方法包括：

(1)提供表達載體，所述表達載體中包含rgC基因的序列；

(2)將表達載體轉化龜裂鏈霉菌，選擇基因組中整合有外源的rgC基因序列的重組龜裂鏈霉菌。

在另一優選例中，所述的方法的步驟(1)中，所述的表達載體中還包含otrC基因；和(2)中，選擇基因組中整合有外源的rgC基因序列、otrC基因序列的重組龜裂鏈霉菌。

在另一優選例中，所述的rgC與otrC基因的序列以串聯的形式存在。

在另一優選例中，所述的表達載體中，rgC序列的5’端，包括ermEp1啟動子。

在另一優選例中，所述的表達載體是pSET152載體。

在本發明的另一方面，提供一種重組的龜裂鏈霉菌，其基因組中整合有外源的1-8個拷貝的rgC基因。

在一個優選例中，所述的重組的龜裂鏈霉菌中還含有1-8個拷貝的外源的1-8個拷貝的otrC基因。

在另一優選例中，所述的重組的龜裂鏈霉菌是通過前面任一所述的方法制備獲得。

在本發明的另一方面，提供一種生產土霉素的方法，所述方法包括：培養前述的重組的龜裂鏈霉菌，從而生產土霉素。

本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、通過增加龜裂鏈霉菌中rgC基因的拷貝數來提高其土霉素產量的流程圖。

圖2、整合質粒pSET152的結構，其包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌體附著位點attP序列，以及篩選標記阿普拉(Aprmycine)抗性基因序列。

圖3、重組質粒pSET152-ermEp1-rgC(pSERC)，其中ermEp1為一個紅霉素強啟動子序列，在重組質粒中位于rgC基因的上游。