技術領域

本發明涉及多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原制備方法及其應用，屬于酶聯免疫技術領域。

背景技術

雙酚A（Bisphenol?A,BPA）為2,?2-雙（4-羥基苯基）丙烷，在體內通過與雌激素受體結合或影響細胞信號傳導途徑等方式模仿或干擾內源雌激素作用，對人的皮膚、呼吸道、消化道和角膜有刺激性。當體內的雙酚A達到一定量時就會破壞肝細胞和腎細胞，造成慢性中毒，使人出現不同程度的頭昏、頭痛、皮疹、精神不安和腹瀉等癥狀。近年來，世界各地桶裝飲用水、嬰兒奶瓶和各種水體中都發現有雌激素類似作用的雙酚A存在（Science.?2007,317(5840):884-885），由于儀器分析方法不適應現場和快速對桶裝飲用水及嬰兒奶瓶中雙酚A進行檢測，而免疫分析基于抗原-抗體間的特異性結合反應，選擇性好，通過選用合適的標記體系，可實現對復雜體系中痕量物質的快速靈敏檢測。酶聯免疫分析方法靈敏度高、特異性強、快速、經濟，非常適合BPA殘留的篩選檢測。

研究雙酚A的酶聯免疫分析方法，首先必須制備得到雙酚A的抗體。雙酚A為小分子化合物，結構簡單，不能直接免疫動物產生抗體，必須先將其與載體蛋白質偶聯制備出完全抗原，利用免疫抗原注射動物誘發產生抗體。目前常用的方法是利用經典的碳二亞胺法或戊二醛法，選擇牛血清白蛋白或卵清蛋白為載體來合成雙酚A人工抗原。申請號為200810234850.2的專利中，胥傳來等介紹了以雙酚酸為半抗原與OVA偶聯制備包被抗原的方法。多聚左旋賴氨酸（PLL）是一種人工合成的多聚肽，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，且具有更多的自由氨基，可以大大提高載體蛋白質與半抗原的偶聯率，所以近來年被越來越多的用以人工免疫抗原的制備中，如中國專利號為200810051488.5中公開的以多聚賴氨酸為載體制備三聚氰胺完全抗原的方法；中國專利專利號200610041918.6提供了伊維菌素人工抗原的合成新方法。但是均未見以多聚賴氨酸為載體制備雙酚A人工包被抗原的專利。

發明內容

針對上述不足，本發明的目的在于提供一種合成方法簡單的以多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原制備方法及其應用，并最終建立了雙酚A檢測的酶聯免疫試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明的前一技術方案是這樣的：一種以多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原制備方法及其應用，以多聚賴氨酸為載體蛋白，與雙酚酸偶聯制備雙酚A包被抗原。

上述的以多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原制備方法及其應用，依次包括下述步驟：1）將雙酚酸完全溶解在有機溶劑中；2）將NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)和EDC·HCL分別完全溶解在機溶劑中；3）將步驟2）制得的溶液滴加至步驟1）制得的溶液中，室溫避光攪拌1-24h，離心分離取上清液得A液；4）將多聚賴氨酸溶于磷酸緩沖溶液中成B液；5）將步驟3）制備的?A液滴加B液中，室溫避光攪拌1-24h，離心分離，上清液轉移到透析袋，用磷酸緩沖溶液透析24-96h，每12?h換一次透析液，最后將透析液經冷凍干燥得到雙酚A人工包被抗原即BVA-PLL；

其中：雙酚酸與NHS、EDC·HCL、多聚賴氨酸的摩爾比為：30～200﹕30～400﹕30～400﹕1。

進一步的，上述的以多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原制備方法及其應用，所述的多聚賴氨酸為多聚左旋賴氨酸或者多聚右旋賴氨酸或者多聚左旋賴氨酸和多聚右旋賴氨酸混合使用。

進一步的，上述的以多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原制備方法及其應用，其特征在于，步驟1）和步驟2）所述的有機溶劑為四氫呋喃或者N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜的其中之一。

進一步的，上述的以多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原制備方法及其應用，步驟4）和步驟5）所述的磷酸緩沖溶液的?pH值為6-8。

本發明的后一技術方案是這樣的：應用雙酚A包被抗原作為雙酚A酶聯免疫檢測試劑盒，所述的雙酚A酶聯免疫檢測試劑盒由包被抗原的固相載體、抗體工作液、雙酚A標準溶液、酶標二抗溶液、抗體稀釋液、洗滌濃縮液、底物溶液和終止液組成；

其中：所述的固相載體為包被有雙酚酸與多聚左旋賴氨酸偶聯物的96孔聚苯乙烯酶標板，并封閉了微孔表面未吸附雙酚A?抗原的位點；所述的雙酚A?標準溶液的濃度分別為：0ng/mL，?3ng/mL，?8ng/mL，25ng/mL，75ng/mL，224ng/mL，673ng/mL，2018ng/mL。

進一步的，上述的以多聚賴氨酸為載體的雙酚A包被抗原的應用，其特征在于，所述的抗體工作液為兔源多克隆抗雙酚A的抗體。