技術領域

本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種蝦類血細胞線粒體膜電位的流式細胞術檢測方法。

背景技術

蝦類是我國重要的經濟水產動物，種類繁多，主要包括凡納濱對蝦（Litopenaeus?vannamei）、斑節對蝦（Penaeus?monodon）、中國明對蝦（Fenneropenaeus?chinensis）、日本囊對蝦（Marsupenaeus?japonicus）、羅氏沼蝦（Macrobrachium?rosenbergii）、克氏原螯蝦（Procambarus?clarkii）等。蝦類是我國水產養殖結構調整、農民增產增收、國家出口創匯的重要農產品。但是，近年來，蝦類養殖頻繁出現大面積發病和死亡，造成嚴重的經濟損失。導致此問題產生的原因有很多，其中養殖水體環境的惡化所帶來的一系列不利影響是最主要的原因之一。因此，環境脅迫對蝦類生理和免疫的影響一直是研究的焦點。

血細胞在蝦類的生理和免疫中均起著十分重要的作用，包括包囊作用、細胞毒活性、吞噬作用、儲存和釋放酚氧化酶原系統等。研究表明各類水體環境因子脅迫會導致對蝦血細胞的免疫功能下降，如pH、鹽度、溫度、亞硝酸鹽、氨氮等。線粒體是合成ATP為細胞生命活動提供能量的重要細胞器，線粒體膜電位是指線粒體內膜兩側離子濃度不同所產生的跨膜電位差，是維持線粒體正常功能所必須的，其下降也是細胞凋亡早期的一個標志性事件。對蝦類血細胞線粒體膜電位進行準確的測定，有利于準確評價血細胞的生理活性和功能，但目前由于缺乏檢測方法，尚沒有蝦類血細胞線粒體膜電位方面的研究報道。

JC-1是一種碳氰化合物類熒光染料，在細胞內以聚合物和單體兩種不同形式存在。線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，產生橙紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，JC-1為單體，產生綠色熒光。通過熒光顏色的轉變便可判斷線粒體膜電位的變化。結合流式細胞術（Flow?cytometry，FCM）進行測定，便可快速、準確地區分線粒體膜電位正常的細胞和線粒體膜電位下降的細胞。流式細胞術目前已成為高等脊椎動物細胞功能的常規檢測，但其在蝦類中尚未得到廣泛應用。

發明內容

為了填補蝦類血細胞線粒體膜電位檢測技術的空白，本發明的目的在于提供一種快速測定蝦類血細胞線粒體膜電位的流式細胞術檢測方法，該方法無需進行細胞洗滌，避免對血細胞造成損傷，具有準確性高、重復性好、測定量大、操作簡便快速的特點。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

蝦類血細胞線粒體膜電位的流式細胞術檢測方法，包括以下步驟：

（1）制備蝦血細胞懸液；

（2）取兩份步驟（1）中的蝦血細胞懸液制作成陽性對照組和陰性對照組，加入熒光染料JC-1與血細胞共孵育，利用該陽性對照組和陰性對照組，通過流式細胞儀確定蝦類血細胞線粒體膜電位正常血細胞的區域和線粒體膜電位下降血細胞的區域；

（3）取一份步驟（1）中的蝦血細胞懸液進行實驗處理，或蝦經過活體實驗處理后制備血細胞懸液，作為實驗組，加入熒光染料JC-1與血細胞共孵育，根據步驟（2）所確定的線粒體膜電位正常血細胞的區域和線粒體膜電位下降血細胞的區域，利用流式細胞儀測定實驗組線粒體膜電位下降血細胞的比例。

步驟（1）和（3）所述的制備蝦血細胞懸液，是將蝦體表水分擦干，用預先抽取了滅菌預冷抗凝劑的無菌注射器，從蝦的圍心腔或腹血竇抽取與抗凝劑等體積的血淋巴，再用預冷的抗凝劑調整細胞濃度后得到蝦血細胞懸液；

所述的抗凝劑由以下方法制備得到：取20.5g葡萄糖、8g檸檬酸鈉與4.2g氯化鈉混合，加蒸餾水定容至1L，調整pH至7.5，高壓滅菌后得到；

所述的蝦血細胞懸液，其中血細胞濃度的數量級優選10⁶cells/ml。

步驟（2）所述的陽性對照組，是在蝦血細胞懸液中加入終濃度為10μmol/L的α-羰基氰化氯苯腙（CCCP），在室溫下避光孵育30min后得到；

步驟（2）所述的陰性對照組，即蝦血細胞懸液；