技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒抗原抗體時(shí)間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測(cè)及檢測(cè)試劑盒，屬于時(shí)間分辨免疫熒光分析法以及體外診斷檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

丙型肝炎病毒(Hepatitis?C?virus,HCV)呈球形，直徑小于80nm（在肝細(xì)胞中為36～40nm，在血液中為36-62nm），為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有刺突。丙型肝炎病毒可引起丙型肝炎主要經(jīng)輸血，針刺，吸毒等傳播。HCV感染通常是持續(xù)性的終生感染，抗體檢測(cè)是一個(gè)非常有效的方法。但因感染HCV后,抗HCV出現(xiàn)較慢，一般情況下，抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)換可以延遲到暴露后幾個(gè)月才發(fā)生，此時(shí)可發(fā)生抗HCV的假陰性(也就是說(shuō)在抗體可檢出之前或在血清學(xué)轉(zhuǎn)換之中即所謂的“窗口期”)，故在早期診斷丙肝感染上有困難。HCV核心抗原檢出時(shí)間早于抗體，HCV-cAg檢測(cè)可作為HCV抗體檢測(cè)的補(bǔ)充試劑。

目前丙型肝炎的檢測(cè)方法主要有三類:

1.丙型肝炎抗體檢測(cè):其缺點(diǎn)是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2-26周的潛伏期，一般到抗HCV抗體出現(xiàn)(轉(zhuǎn)陽(yáng))有一個(gè)較長(zhǎng)的窗口期，平均為70d，有的患者窗口期可延長(zhǎng)至6-9個(gè)月或更長(zhǎng)。由于窗口期的存在，對(duì)潛伏期和隱形感染者容易造成漏檢，機(jī)體感染HCV后，在抗HCV抗體出現(xiàn)之前約2周左右，血循環(huán)中即可出現(xiàn)病毒顆粒，此時(shí)丙型肝炎病毒HCV的RNA經(jīng)PCR方法檢測(cè)可為陽(yáng)性，血液具有感染性，而用抗體檢測(cè)方法根本無(wú)法測(cè)出；

2.丙型肝炎病毒HCV核酸檢測(cè):感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即可檢測(cè)到HCV-RNA。因此，HCV核酸檢測(cè)(HCV?RT-PCR檢測(cè))可用于丙型肝炎的早期診斷，并且通過(guò)對(duì)病毒拷貝數(shù)的定量檢測(cè)可對(duì)其臨床療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因?yàn)镻CR法檢測(cè)HCV-RNA影響因素較多，在樣本收集、儲(chǔ)存和檢測(cè)方面都有嚴(yán)格的要求，并且PCR的檢測(cè)操作過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)；

3.丙型肝炎抗原檢測(cè):丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最為保守的部分編碼而來(lái)，在HCV-RNA出現(xiàn)后的1-2d內(nèi)即出現(xiàn)丙型肝炎病毒HCV抗原，且與HCV-RNA的水平相平行，可以作為HCV復(fù)制的標(biāo)志。有研究表明，HCV抗原檢測(cè)與抗HCV抗體檢測(cè)相比，HCV抗原的檢測(cè)可使檢測(cè)的窗口期平均提前49天，縮短窗口期HCV感染者的獻(xiàn)血的風(fēng)險(xiǎn)。與RT-PCR方法相比具有操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、對(duì)環(huán)境要求低的特點(diǎn)，在臨床上可用于早期急性丙型肝炎診斷。

????時(shí)間分辨免疫熒光分析(Time-resolved?fluoroimmunoassay,TRFIA)是在熒光分析（FIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種特殊的熒光分析法。它利用了具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物，標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞，以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。用時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，準(zhǔn)確地測(cè)定反應(yīng)體系中被分析物的濃度。TRFIA?所使用的熒光標(biāo)記物是鑭系稀土金屬，由于鑭系稀土金屬離子螯合物有很長(zhǎng)的熒光壽命(微秒級(jí))，有別于傳統(tǒng)熒光的短熒光壽命，使其能通過(guò)時(shí)間分辨方式區(qū)別于背景熒光（鈉秒級(jí)），正是由于熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，可以延緩測(cè)量時(shí)間，待測(cè)樣品中短壽命的本底熒光衰變后再測(cè)稀土離子的特異熒光，因此可完全消除本底熒光的干擾。鑭系稀土金屬離子螯合物熒光很寬的Stokes?位移使其容易通過(guò)波長(zhǎng)分辨方式進(jìn)一步區(qū)別于背景熒光，提高方法學(xué)的穩(wěn)定性。鑭系稀土金屬離子螯合物狹窄的熒光發(fā)射峰使其熒光檢測(cè)具有很高的效率，進(jìn)一步提高了信號(hào)檢測(cè)的特異性和靈敏性。此外，由于檢測(cè)時(shí)加入了熒光增強(qiáng)液，它可使原來(lái)熒光增強(qiáng)100萬(wàn)倍，以上各種因素使TRFIA?的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于丙型肝炎病毒抗原抗體時(shí)間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測(cè)及檢測(cè)試劑盒，主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作煩瑣及污染環(huán)境等技術(shù)問(wèn)題。最主要解決的問(wèn)題是縮短窗口期，可用于早期急性丙型肝炎診斷。