技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶法合成食品添加劑領(lǐng)域，具體涉及一種離子液體共溶劑效應(yīng)強(qiáng)化酶促合成異槲皮苷的方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)：異槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Quercetin-3-glucose)，是自然界中非常罕見(jiàn)的一種具有顯著的抗氧化性、抗腫瘤等生物活性的黃酮類(lèi)化合物，是國(guó)際上各大醫(yī)藥食品公司競(jìng)相開(kāi)發(fā)的高級(jí)食品添加劑、輔助藥物或藥物有效成分，也是國(guó)際上新型多功能食品添加劑EMIQ(Enzymatically?Modified?Isoquercitrin)的合成原料（Toxicology，2010，268(3)：213-218）。從天然植物中分離提取異槲皮苷，這類(lèi)方法通常需要使用大量的有機(jī)溶劑，且耗時(shí)費(fèi)力，生產(chǎn)效率低。酸水解產(chǎn)生的大量酸性廢水嚴(yán)重污染環(huán)境，且蘆丁酸水解過(guò)程中槲皮素和異槲皮苷并存，這也增加了后期分離純化的成本（African?Journal?of?Biotechnology，2011，10(8)：1460-1466）。目前建立的生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷的酶促水解工藝（Journal?ofMolecular?Catalysis?B：Enzymatic，2012，81：34-42）是公認(rèn)的制備異槲皮苷最具前景的生產(chǎn)工藝。因而，提高糖苷酶酶促反應(yīng)的速度和效率是提高蘆丁轉(zhuǎn)化率和異槲皮苷得率的關(guān)鍵技術(shù)之一。

離子液體（Ionic?Liquids，ILs）是由帶正電荷的離子和帶負(fù)電荷的離子構(gòu)成，在-100℃和200℃間呈液體狀態(tài)。ILs具有蒸汽壓小、溶解性好、不揮發(fā)等傳統(tǒng)溶劑所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)。離子液體具有很強(qiáng)的可塑性，即可以組合不同的陰陽(yáng)離子來(lái)適應(yīng)反應(yīng)底物的極性，從而提高底物的溶解性和酶促反應(yīng)速率（Journal?of?Molecular?Catalysis?B：Enzymatic，2010，65：68-72）。嗜熱蛋白酶在離子液體中有較高的熱穩(wěn)定性（BiotechnologyProgress，2000，16：1129-1131），80℃條件下，在離子液體[BMIM][PF₆]水浴20h后，酶活性增加了20％（Green?Chemistry，2002，4：147-151）。脂肪酶經(jīng)離子液體[Bmim][PF₆]、[Emim][Tf₂N]、[Bmim][BF₄]和[Emim][BF₄]處理后，活性分別增加1．81、1．66、1．56和1．6倍（Journal?ofMolecular?Catalysis?B：Enzymatic，2007，45(3-4)：118-121）。離子液體中的陰離子是影響酶活的重要因素，[NO₃]，[CF₃CO₂]，[CH₃CO₂]等比[PF₆]具有更高的親核性，使得它們能更好地與脂肪酶中帶正電荷的位點(diǎn)結(jié)合，影響酶的構(gòu)象從而影響酶的活性（Journal?of?the?American?Chemical?Society，2003，125(14)：4125-4131）。專(zhuān)利US2008299623A1中報(bào)道了在酶催化反應(yīng)中，含有離子液體的反應(yīng)介質(zhì)可以提高底物溶解性，提高酶的活性及選擇性，減少產(chǎn)物抑制和副反應(yīng)的發(fā)生。脂肪酶CALB在離子液體[EMIM][BF₄]中催化葡萄糖的酯化反應(yīng)具有很高的選擇性，在[MOEMIM][BF₄]中反應(yīng)迅速，且55℃時(shí)葡萄糖的溶解度可達(dá)5g/L，是丙酮中的100多倍（Current?Opinion?in?Biotechnology，2003，14：432-437）。β-半乳糖苷酶催化N-乙酰葡萄糖胺生產(chǎn)乳糖的反應(yīng)中，由于產(chǎn)物N-乙酰乳糖胺的競(jìng)爭(zhēng)性二級(jí)水解使產(chǎn)率受到抑制。此反應(yīng)在[MMIm][MeSO₄]／水（V／V25∶75）中進(jìn)行時(shí)，產(chǎn)率達(dá)58％，而在水-緩沖液體系中進(jìn)行時(shí)，產(chǎn)率僅為30％（Biotechnology?and?bioengineering，2006，95(6)：1093-1100）。然而，尚未見(jiàn)以離子液體作共溶劑強(qiáng)化酶促合成異槲皮苷的報(bào)道。

以緩沖水溶液為介質(zhì)的傳統(tǒng)反應(yīng)體系中，蘆丁的溶解度低，且酶促反應(yīng)效率差。本專(zhuān)利中，在傳統(tǒng)的水溶液反應(yīng)體系中加入離子液體，有利于提高底物溶解度，提高酶促反應(yīng)效率，且操作簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境友好。

發(fā)明內(nèi)容