技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及了一種人源dcf1的新用途。特別是人源dcf1基因在腦膠質(zhì)瘤細胞的抑制與凋亡中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

腦膠質(zhì)瘤（glioma）是由神經(jīng)外胚層分化而來的膠質(zhì)細胞（星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和室管膜等）發(fā)生的腫瘤。膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率位于第一位，約占45%左右。膠質(zhì)瘤的治療問題是神經(jīng)外科中較為棘手的一個問題，由于其死亡率高，預后較差，無法控制的細胞增殖、細胞凋亡減慢，腫瘤細胞侵襲性強等使腫瘤的治療面臨巨大的困難，患病后手術(shù)加放化療的平均生存期僅為8～11個月。目前腫瘤治療主要有以下幾種方法：手術(shù)治療、化學藥物、治療放射治療、光動力治療。但這四種治療方法對大腦損傷性大，易復發(fā)，對患者機體消耗大，也無法起到根治目的。

樹突狀細胞因子（dendritic?cell?factor?1，dcf1）又名跨膜蛋白59（transmembrane?protein?59，tmem59），是單次跨膜蛋白。根據(jù)基因芯片GDS2853分析顯示，隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，dcf1基因表達量呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)。同時，dcf1基因敲除小鼠基因芯片和蛋白芯片表明，敲除dcf1后，gfap（膠質(zhì)細胞標記物）表達量上調(diào)。2008年Wang,?L;?et?al研究證明，在神經(jīng)干細胞中，過量表達dcf1，可維持神經(jīng)干細胞未分化狀態(tài)，而沉默dcf1則能促進神經(jīng)干細胞的分化。2012年?Li,?X;?et?al通過小分子microRNA-351，下調(diào)dcf1的表達后，神經(jīng)干細胞系C17.2向膠質(zhì)方向分化。以上結(jié)果都表明，dcf1表達量下調(diào)可能促進膠質(zhì)細胞發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種人源dcf1基因在誘導U251膠質(zhì)瘤細胞系凋亡中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之二在于提供人源dcf1基因在抑制U251膠質(zhì)瘤細胞系增值中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之三在于提供人源dcf1基因在抑制腫瘤生長中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明通過培養(yǎng)U251膠質(zhì)瘤細胞系，運用Lipofectamine??2000?Transfection?Reagent?陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，在U251細胞中分別轉(zhuǎn)染pEGFP-N2和pEGFP-N2-DCF1，使其分別表達EGFP綠色熒光蛋白和EGFP-DCF1融合蛋白，前者作為對照。發(fā)綠色熒光的融合蛋白可指示dcf1在細胞中的分布，進一步運用dcf1一抗和膠體金二抗，可在電鏡下觀察膠體金顆粒，從而確定其亞細胞定位。通過CCK8試劑盒，檢測細胞增殖能力。JC-1染料檢測細胞線粒體膜電位。電鏡和原子力顯微鏡觀察線粒體外觀，判斷線粒體是否發(fā)生病變。Western檢測過表達dcf1后凋亡相關(guān)蛋白表達量是否發(fā)生變化，從而在凋亡機制上做初步探索。運用裸鼠腫瘤異位移植技術(shù)，在體內(nèi)層面判斷dcf1基因?qū)δz質(zhì)瘤的治療作用。

本發(fā)明通過免疫電鏡、原子力顯微鏡、CCK8增殖檢測、JC-1染色、裸鼠腫瘤異位移植等方法對dcf1誘導U251細胞系凋亡做出判斷，結(jié)果表明dcf1通過定位于線粒體引起線粒體結(jié)構(gòu)病變，膜電位下降，從而引起凋亡相關(guān)基因表達量發(fā)生改變，最終導致凋亡。裸鼠實驗表明，dcf1能顯著減小膠質(zhì)瘤的腫瘤體積，抑制腫瘤生長。

附圖說明

圖1為：dcf1基因擴增及重組質(zhì)粒pEGFP-N2-DCF1酶切鑒定。A圖為以Hela細胞cDNA為模板，通過PCR法擴增獲得人源dcf1基因片段，全長972bp。圖中最左邊泳道為DNA?Marker（SM#0311），泳道1為dcf1基因PCR后擴增產(chǎn)物。B圖為重組質(zhì)粒pEGFP-N2-DCF1酶切鑒定圖。泳道1為空載pEGFP-N2經(jīng)EcoRI單酶切，2-5為陽性克隆經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后釋放出目的條帶dcf1(972bp)及空載片段(4700bp)。表明重組質(zhì)粒pEGFP-N2-DCF1構(gòu)建成功，經(jīng)測序驗證正確后用于后續(xù)實驗方案。