技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種一步法乙肝病毒前S1(PreS1)抗原(Ag)酶聯(lián)免疫測定試劑盒及制備方法。?

背景技術(shù)

我國屬于乙型肝炎病毒高發(fā)區(qū)，乙型肝炎已經(jīng)成為危害我國人民身體健康的社會公眾性問題，乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物(HBVM)作為乙型肝炎病毒診斷的常規(guī)項目已不能滿足臨床，HBV-DNA、病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒前S1(PreS1Ag)抗原都作為HBV在人體內(nèi)感染和復(fù)制的證據(jù)。?

HBV為嗜肝DNA病毒，由一個不完全雙鏈DNA組成，約3200個氨基酸，有4個開放讀碼框為S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)、X區(qū)。S基因區(qū)又可分成三段，從上游開始依次為前S1(preS1)區(qū)、前S2(preS2)區(qū)和S區(qū)。PreS1原具有較強的免疫原性，是由108或119個氨基酸組成。HBV以前S1區(qū)氨基酸21-47片段作為結(jié)合部位結(jié)合肝細胞，只要這一片段完好就有傳染性和高度的免疫源性。PreS1抗原出現(xiàn)在急性乙型肝炎病毒感染的最早期，比HbeAg出現(xiàn)早，是早期傳染性的標(biāo)志。乙型肝炎病毒的大量復(fù)制，導(dǎo)致大量的PreS1Ag表達，刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致大量肝細胞損傷，并認為PreS1作為HBV的外殼蛋白成份，在HBV感染宿主細胞的過程中起著關(guān)鍵的作用，最重要的介導(dǎo)部位是前S1蛋白的氨基(AA)21-47片段，變異的病毒只要這一區(qū)段完好就有傳染性。?

PreS1在病毒感染機體的整個周期中，PreS1的獨特作用，使其能夠較充分的反應(yīng)機體的體液免疫狀況，直至病程的轉(zhuǎn)陰過程，如急性肝炎時PreS1Ag陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早跡象，反之，PreS1Ag持續(xù)陽性，急性肝炎將發(fā)展至慢性肝炎。因此，PreS1Ag與HBV-DNA在反映乙肝病毒復(fù)制有良好的一致性。PreS1Ag較HBeAg更敏感地反映HBV復(fù)制的情況。?

但是目前普遍使用雙抗體夾心法檢測乙肝病毒PreS1抗原，具有很好的特異性，但是單純利用無力吸附吧單克隆抗體或者多克隆抗體吸附在酶標(biāo)板上會存在單抗使用量大，活性損失大，特別是批間精密度差等缺點，而將親和素包被在板上，再加入生物素化的抗體，則可以很好的解決這一問題，其不但可以減少批間差，而且可以在檢測過程中可一步直接加入樣品血清和酶標(biāo)記抗體進行反應(yīng)，形成固相親和素-生物素話抗體-乙肝病毒PreS1抗原-酶標(biāo)抗PreS1抗原抗體復(fù)合物，然后加入底物緩沖液甲和乙進行反應(yīng)，就可以定量分析血清中的乙肝病毒PreS1抗原的含量。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于解決傳統(tǒng)酶標(biāo)板批間差不足的問題，設(shè)計并建立了一步法PreS1抗原的檢測試劑盒。?

本發(fā)明提供了一種“一步法PreS1抗原酶聯(lián)免疫測定試劑盒”，該試劑盒是包括主要成分親和素預(yù)先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreS1單克隆抗體或抗HBS抗體的酶標(biāo)板包被反應(yīng)條、酶標(biāo)記前S1抗體、陽性對照液一支、陰性對照液一支、20倍濃洗滌液1瓶、底物緩沖液甲1瓶、底物緩沖液乙1瓶及終止液(2N?H2SO4)1瓶組成。?

1、抗體制備：?

(1)利用HBV-DNA重組PreS1?Ag基因片段通過原核表達或者真核表達制備抗原；?

(2)制備抗體的制備和純化：用上述重組抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽性鼠脾細胞與骨髓瘤；細胞融合成雜交瘤細胞，篩選陽性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進行純化，得純抗PreS1抗體，其純度95％以上。?

(3)用親和素先包被酶標(biāo)板，并加入生物素標(biāo)記的抗乙肝病毒PreS1單克隆抗體或抗HBS進行二次包被反應(yīng)，制成抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔；?

(4)辣根過氧化物酶(HRP)與純化的抗乙肝病毒PreS1抗體酶聯(lián)，制成酶標(biāo)抗體；?

(5)配制陽性對照液、陰性對照液；?

(6)配制20倍濃縮洗液；?

(7)配制底物緩沖液甲；?

(8)配制底物緩沖液乙；?

(9)配制終止液(2N?H2SO4)。?

(10)分裝上述試劑盒除預(yù)報被板其余七種成分，按需要分裝在小瓶或尖底離心管中；?

(11)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性合格；?

(12)組裝成成品。?

2、本發(fā)明的試劑盒在使用時可以如下操作：?

(1)取出已包被條孔或板，恢復(fù)至室溫。?

(2)配液：將濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋備用(20倍濃洗滌液1ml+19ml蒸餾水即為工作液)。?