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[發明專利]芝麻栽培種與Sesamum radiatum野生種遠緣雜交后代的分子鑒定方法有效

專利信息
申請號: 201210318496.8 申請日: 2012-08-31
公開(公告)號: CN102965431A 公開(公告)日: 2013-03-13
發明(設計)人: 張海洋;苗紅梅;張體德;魏利斌;李春;琚銘;王慧麗 申請(專利權)人: 河南省農業科學院
主分類號: C12Q1/68 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119 代理人: 牛愛周
地址: 450002 *** 國省代碼: 河南;41
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摘要:
搜索關鍵詞: 芝麻 栽培 sesamum radiatum 野生 遠緣 雜交 后代 分子 鑒定 方法
【權利要求書】:

1.檢測芝麻栽培種與Sesame?radiatum野生種遠緣雜交后代的的SSR引物,包括:

引物對HS209

正向引物序列:5’-GCAAGAAGCCGACATGTTTA-3’(Tm=53.35℃)

反向引物序列:5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’(Tm=55.4℃)。

2.一種如權利要求1所述的引物用于芝麻栽培種與Sesame?radiatum野生種遠緣雜交后代的分子鑒定方法,其特征在于,具體步驟如下:

(1)挑選飽滿健康的芝麻栽培種(Sesame?indicum?L.,2n=26)與野生種(Sesame?radiatum,2n=64)種子,6月播種后于7月下旬植株進入花期,進行人工授粉雜交,采用組織培養方法對雜交后代幼胚進行培養,獲得遠緣雜交F1后代;

(2)提取步驟(1)中芝麻栽培種(Sesame?indicum?L.,2n=26)、野生種(Sesame?radiatum,2n=64)及雜交后代F1基因組DNA,作為模板備用;

(3)將步驟(2)提取的DNA模板應用于PCR反應體系,運行PCR擴增程序,在引物對HS209的引導下,得到PCR反應產物;

(4)將步驟(3)的PCR反應產物進行凝膠電泳檢測,檢測結果有栽培種特異性條帶210bp和野生種特異性條帶200bp、230bp的為真雜種;其余則為假雜種。

3.根據權利要求2所述的分子鑒定方法,其特征在于,所述的基因組DNA的提取方法:取植株葉片,加入預冷的提取緩沖液,研磨,4℃離心,棄上清,于沉淀中加入預熱的裂解緩沖液,65℃水浴,加入氯仿/異戊醇混合液,混勻,15℃離心,取上清,加預冷的異丙醇,混勻,靜置,離心,棄上清,于沉淀中加入乙醇洗滌,離心,倒掉上清后干燥,加TE緩沖液,4℃溶解DNA30min以上,于20℃保存備用。

4.根據權利要求3所述的分子鑒定方法,其特征在于,所述的提取緩沖液包括:0.35MGlucose,0.1M?Tris-HCl,5mM?Na-EDTA,2%PVP,1%(V/V)β-Me,余量為無菌超純水。

5.根據權利要求3所述的分子鑒定方法,其特征在于,所述的裂解緩沖液包括:1.4MNaCl,0.1M?Tris-HCl,20mM?Na-EDTA,2%CTAB,2%PVP,1%(V/V)β-Me,余量為無菌超純水。

6.根據權利要求3所述的分子鑒定方法,其特征在于,所述的TE緩沖液包括:10mMTris-HCl(PH?8.0),1mM?EDTA(PH?8.0),余量為無菌超純水。

7.根據權利要求2所述的分子鑒定方法,其特征在于,所述的PCR反應體系為:DNA模版50ng,10×Buffer?1μL,10mmol·L-1dNTPs?0.2μL,10μg·L-1引物對HS2091μL,2.5U·μL-1Taq?DNApolymerase?0.5μL,加入無菌超純水至終體積10μL。

8.根據權利要求2所述的分子鑒定方法,其特征在于,所述的PCR擴增程序為:94℃變性3min,94℃變性l?min,58℃退火45s,72℃延伸60s,30個循環,72℃總延伸10min;4℃保存。

9.根據權利要求2所述的分子鑒定方法,其特征在于,凝膠電泳檢測為:聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%,電泳緩沖液為1×TBE,150V恒壓電泳2小時,電泳結束后,凝固定先膠,再銀染,漂洗,顯色,漂洗凝膠后記錄讀取數據。

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