[發明專利]一種人外周血免疫細胞庫的構建方法有效
| 申請號: | 201210269737.4 | 申請日: | 2012-07-30 |
| 公開(公告)號: | CN102758259A | 公開(公告)日: | 2012-10-31 |
| 發明(設計)人: | 王肇光;薛書奎;蔡平平;田甜;邢曉;李財新;陳莉 | 申請(專利權)人: | 濟南賽爾生物科技有限公司 |
| 主分類號: | C40B50/06 | 分類號: | C40B50/06;C40B40/02;C12N5/0786;C12N5/0783;C12N5/0781 |
| 代理公司: | 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219 | 代理人: | 王緒銀 |
| 地址: | 250101 山東省濟南市高新(歷*** | 國省代碼: | 山東;37 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 人外周血 免疫 細胞 構建 方法 | ||
1.一種人外周血免疫細胞庫的構建方法,步驟包括:采集人外周血,分離自體血漿,分離外周血單個核細胞,由外周血單個核細胞分離單核細胞并凍存,由外周血單個核細胞分離T淋巴細胞并凍存,由外周血單個核細胞分離B淋巴細胞并凍存,由外周血單個核細胞分離NK細胞并凍存,編碼入庫;其特征在于:
所述人外周血采集前,供體應查體符合獻血標準;
所述分離自體血漿的方法是:將采集的外周血轉到離心管中,以1000-2500轉/分鐘離心5~15分鐘,取上清液得到自體血漿,56℃滅活30分鐘后,置-20℃凍存,備用;
所述分離外周血單個核細胞的方法是:將上述去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋1倍,再加入其0.5~2倍體積量的1wt%~6wt%的羥乙基淀粉溶液,混勻后靜置10~40分鐘,分離出上清,并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上,2000~5000轉/分離心10~30分鐘,離心后管內分三層,取中間層細胞即得到外周血單個核細胞;
所述分離單核細胞并凍存的方法是:將得到的外周血單個核細胞按照0.1~10×107/ml的密度懸浮在組分為10?wt%FBS+90?wt%1640的培養基中,并按照30ml/瓶的量分裝在滅菌的150cm2細胞培養瓶中,靜置1h~5h,然后吸取上清液,備用;剩余貼壁細胞即為單核細胞,用生理鹽水或PBS將貼壁的單核細胞吹打下來,800~1500轉/分離心5~10分鐘后,以1~10×105的密度進行分裝并液氮凍存,凍存液配方為10?wt%DMSO+6wt%羥乙基淀粉+84?wt%自體血漿;
所述分離T淋巴細胞的方法是:采用免疫磁珠法對分離單核細胞收集的上清液進行T淋巴細胞分選,免疫磁珠法采用正分選法,抗體選用CD3抗體,分離出T淋巴細胞后800~1500轉/分離心5~10分鐘,再以0.1~10×107的密度進行分裝并液氮凍存,凍存液配方為10?wt%DMSO+6?wt%甲基纖維素400CP+84?wt%自體血漿;
所述分離B淋巴細胞的方法是:繼續用分離T淋巴細胞的方法對分離單核細胞收集的上清液進行B淋巴細胞分選,同樣采用正分選法,抗體采用CD19或CD20,分離出B淋巴細胞后800~1500轉/分離心5~10分鐘,再以0.1~10×107的密度進行分裝并液氮凍存,凍存液配方為10?wt%DMSO+6?wt%右旋糖酐40+84?wt%自體血漿;
所述分離NK細胞的方法是:繼免疫磁珠法分離T和B淋巴細胞后,剩余的細胞即為NK細胞,將所述細胞800~1500轉/分離心5~10分鐘后,以0.1~10×106的密度進行分裝并液氮凍存,凍存液配方為10?wt%DMSO+6?wt%海藻糖+84?wt%自體血漿;
所述編碼入庫的方法是:對分離并凍存的各種細胞按照每人一組系統編號,并將個人信息包括編號和保存位置信息統一輸入計算機,用于管理與檢索。
2.如權利要求1所述人外周血免疫細胞庫的構建方法,其特征在于:所述分離外周血單個核細胞的方法是:將去除自體血漿后的沉淀物按體積量計用生理鹽水或PBS稀釋1倍,再加入其0.5倍體積量的4wt%的羥乙基淀粉溶液,混勻后靜置30分鐘,分離出上清,并將上清液加入到等體積量的淋巴細胞分離液液面上,3000轉/分離心20分鐘,離心后管內分三層,取中間層細胞即得到外周血單個核細胞。?
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