技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種可控性精氨酸偶聯(lián)殼聚糖的制備方法。

背景技術(shù)

殼聚糖是甲殼素脫乙酰的產(chǎn)物，由2－氨基葡萄糖分子之間借助β－1，4－糖苷鍵形成的高分子物質(zhì)。它也是唯一一個(gè)堿性陽(yáng)離子多糖的天然聚合物,具有生物相容性好，可生物降解，來(lái)源廣，制備簡(jiǎn)單，無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，在生物材料領(lǐng)域是公認(rèn)的優(yōu)秀候選材料之一。在弱酸溶液中完全溶解的殼聚糖，易于與DNA天然結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以有效地防止生物酶對(duì)DNA的降解，因此殼聚糖是一個(gè)很有前景的基因載體。實(shí)驗(yàn)研究表明雖然殼聚糖可有效將所載基因轉(zhuǎn)入人肺癌A509細(xì)胞、黑素瘤B26細(xì)胞和子宮頸癌Hela細(xì)胞等，但其轉(zhuǎn)染效率離實(shí)際需求差距較大，嚴(yán)重阻礙了其進(jìn)一步的應(yīng)用。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸修飾的殼聚糖作為基因載體可有效的進(jìn)行基因遞送，并明顯的提高其基因表達(dá)效率，而且細(xì)胞毒性極低。但其精氨酸取代度受其合成方法制約，目前文獻(xiàn)報(bào)道的取代度在20.1%左右。故此，如何采用了新的合成路線以控制精氨酸的取代度，并且進(jìn)一步摸索出在較高的精氨酸的取代度的情況下，提高其基因遞送效果和基因表達(dá)效率是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可控性精氨酸偶聯(lián)殼聚糖的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種可控性精氨酸偶聯(lián)殼聚糖的制備方法,包括如下步驟：

(1)精氨酸酯化：

按摩爾比為1：1.5-5的比例稱取精氨酸和酰化試劑，加入到C1-C11的無(wú)水醇中，精氨酸與無(wú)水醇的質(zhì)量比為1:5-8，在20-70℃水浴反應(yīng)1-20小時(shí)，減壓蒸干，得到精氨酸酯；

（2）對(duì)精氨酸酯進(jìn)行氨基保護(hù)得到氨基保護(hù)精氨酸酯；

（3）脫酯反應(yīng)：向氨基保護(hù)精氨酸酯中加入無(wú)機(jī)堿，加入體積濃度為70-95%的甲醇水溶液作為溶劑，35-80℃反應(yīng)1-36小時(shí)，加酸中和至pH為6-7，蒸干溶劑，得到氨基保護(hù)的精氨酸；所述無(wú)機(jī)堿與精氨酸的摩爾比為1.2-4:1；

（4）氨基保護(hù)的精氨酸修飾殼聚糖：

將殼聚糖溶于醋酸水溶液中，加入氨基保護(hù)的精氨酸與偶聯(lián)劑，室溫?cái)嚢?0-14小時(shí)，超濾或透析除去過(guò)量的氨基保護(hù)的精氨酸和偶聯(lián)劑，冷凍干燥，得到氨基保護(hù)的精氨酸修飾的殼聚糖；所述精氨酸、殼聚糖和偶聯(lián)劑的摩爾比為1：1-20：2-4000；所述醋酸水溶液中醋酸的質(zhì)量含量為1-5%；

（5）脫氨基保護(hù)

將氨基保護(hù)的精氨酸修飾的殼聚糖放入高壓釜中，加入鈀/碳作催化劑，加入溶劑二甲基甲酰胺或二甲基亞砜，所述氨基保護(hù)的精氨酸修飾的殼聚糖與鈀/碳的質(zhì)量比是40-60:1，通入氫氣保持28-40個(gè)大氣壓，25-70℃反應(yīng)3-8小時(shí)，蒸干溶劑，反應(yīng)產(chǎn)物溶解在0.1-1摩爾/升的pH=4.0-5.5的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中，過(guò)濾除去鈀/碳，經(jīng)透析、冷凍干燥得到可控制精氨酸偶聯(lián)殼聚糖。

C1-C11的無(wú)水醇優(yōu)選：無(wú)水乙醇、無(wú)水丙醇或無(wú)水丁醇。

酰化試劑優(yōu)選：二氯亞砜、三甲基氯硅烷或2,2-二甲氧基丙烷至少一種。

步驟（2）對(duì)精氨酸酯進(jìn)行氨基保護(hù)可以采用常規(guī)的方法，優(yōu)選的方法是：將精氨酸酯加入到溶劑二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中，加入有機(jī)堿，氨基保護(hù)劑，室溫反應(yīng)4-24小時(shí)，蒸干溶劑得到粗產(chǎn)物，在粗產(chǎn)物中加入飽和的碳酸氫鈉水溶液攪拌后用乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相，所述用乙酸乙酯萃取的次數(shù)為2-3次，合并有機(jī)相；再用與有機(jī)相等量的水加入至有機(jī)相中萃取，除去水溶性副產(chǎn)物，所述用水萃取的次數(shù)為2-3次，收集并蒸干有機(jī)相，得到氨基保護(hù)精氨酸酯；其中：溶劑、精氨酸酯和有機(jī)堿的質(zhì)量比優(yōu)選：70-140:1:1-10，所述精氨酸酯與氨基保護(hù)劑的摩爾比為1:1.5-4，所述精氨酸酯、第一次加入飽和的碳酸氫鈉水溶液和每次加入的乙酸乙酯的質(zhì)量比為1:10:9；氨基保護(hù)劑優(yōu)選：芐氧羰酰氯或?qū)ο趸S氧羰酰氯；有機(jī)堿優(yōu)選：三乙胺或吡啶。

無(wú)機(jī)堿優(yōu)選：氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

偶聯(lián)劑優(yōu)選：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺,1－環(huán)己基－3－（2－馬啉代乙基）碳二亞胺，N,N'-二異丙基碳二酰亞胺，N-乙基-3-苯基異惡唑-3'-磺酸鹽，N,N'-羰基二咪唑和p-疊氮苯甲酰基酰肼至少一種。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的可控性精氨酸偶聯(lián)殼聚糖具有良好的生物相容性，生物可降解性。