[發明專利]miR-885-5p在制備判斷原發性肝癌臨床分期的診斷試劑中的用途有效
| 申請號: | 201210222211.0 | 申請日: | 2012-06-28 |
| 公開(公告)號: | CN102888453A | 公開(公告)日: | 2013-01-23 |
| 發明(設計)人: | 田亞平;張竹紅 | 申請(專利權)人: | 中國人民解放軍總醫院 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68 |
| 代理公司: | 北京君智知識產權代理事務所 11305 | 代理人: | 向華 |
| 地址: | 100853 北京市海*** | 國省代碼: | 北京;11 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | mir 885 制備 判斷 原發性 肝癌 臨床 分期 診斷 試劑 中的 用途 | ||
1.一種檢測miR-885-5p的雜交探針在制備用于判斷原發性肝癌臨床分期的診斷試劑中的用途,其特征在于雜交探針的序列為:5’AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3’。
2.根據權利要求1所述的用途,其特征在于所述的miR-885-5p雜交探針是經過標記的探針。
3.根據權利要求2所述的用途,其特征在于所述的miR-885-5p雜交探針是經過地高辛標記的探針。
4.根據權利要求2所述的用途,其特征在于使用所述診斷試劑判斷原發性肝癌臨床分期的步驟如下:
(1)脫蠟和水化,具體步驟如下:
①組織切片置于二甲苯Ⅰ中浸泡5分鐘,
②組織切片置于二甲苯Ⅱ浸泡5分鐘,
③組織切片置于二甲苯Ⅲ浸泡5分鐘,
④組織切片置于99.9%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下,
⑤組織切片置于99.9%乙醇Ⅱ中上下浸泡10下,
⑥組織切片置于99.9%乙醇Ⅲ浸泡5分鐘,
⑦組織切片置于96%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下,
⑧組織切片置于96%乙醇Ⅱ中浸泡5分鐘,
⑨組織切片置于70%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下
⑩組織切片置于70%乙醇Ⅱ中浸泡5分鐘,
(2)組織切片置于磷酸鹽緩沖液中浸泡2-5分鐘;
(3)孵育蛋白酶K,將100μl濃度為15μg/ml的蛋白酶K滴加與組織切片表面,37℃孵育10分鐘;
(4)用磷酸鹽緩沖液洗處理過的組織切片2次,每次五分鐘;
(5)組織切片脫水,具體步驟如下:
①組織切片置于70%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下,
②組織切片置于70%乙醇Ⅱ中浸泡5分鐘,
③組織切片置于96%乙醇Ⅰ中上下浸泡10下,
④組織切片置于96%乙醇Ⅱ中浸泡1分鐘,
⑤組織切片置于99.9%乙醇Ⅰ上下浸泡10下,
⑥組織切片置于99.9%乙醇Ⅱ浸泡1分鐘;
(6)探針與miR-885-5p的雜交,將雜交液(50nM)100μl滴加在組織切片中,將其放入濕盒中,55℃孵育1小時;
(7)SSC緩沖液洗組織切片,具體步驟如下:
①組織切片置于55℃的5×SSC緩沖液浸泡5分鐘
②組織切片置于55℃的5×SSC緩沖液浸泡5分鐘,
③組織切片置于55℃的1×SSC緩沖液浸泡5分鐘
④組織切片置于55℃的1×SSC緩沖液浸泡5分鐘,
⑤組織切片置于55℃的1×SSC緩沖液浸泡5分鐘,
⑥組織切片置于55℃的0.2×SSC緩沖液浸泡5分鐘;
(8)封閉液封閉,室溫靜置15分鐘;
(9)滴加連有堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1:800)100μl,室溫靜置1小時;
(10)PBST緩沖液洗3次,每次5分鐘。
(11)KTBT緩沖液洗2次,每次5分鐘。
(12)去離子水洗2次,每次1分鐘。
(13)核固紅100ml滴加于組織切片上染核,室溫靜置10分鐘。
(14)流水洗組織切片10分鐘。
(15)脫水、透明,具體步驟如下:
①組織切片置于70%乙醇中浸泡30秒,
②70%乙醇中浸泡1分鐘,
③組織切片置于96%乙醇中上下浸泡10下,
④組織切片置于96%乙醇中浸泡1分鐘,
⑤組織切片置于99.9%乙醇Ⅱ上下浸泡10下,
⑥組織切片置于99.9%乙醇Ⅲ浸泡1分鐘;
⑦二甲苯Ⅱ中浸泡5分鐘,
⑧二甲苯Ⅰ浸泡5分鐘;
(16)樹脂封片、鏡檢。
5.一種通過原位雜交技術判斷原發性肝癌臨床分期的試劑盒,其特征在于所述試劑盒包括權利要求1-3中任意一項權利要求所述的檢測miR-885-5p的雜交探針和原位雜交使用的其他常用試劑。
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