技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種高效轉(zhuǎn)化頭孢菌素C的基因工程菌及其制備方法。

背景技術(shù)

近些年來，頭孢菌素以其高成長性和良好的臨床表現(xiàn)，在全球抗感染藥物市場上占有越來越多的市場份額。我國的頭孢菌素產(chǎn)業(yè)自上世紀(jì)80年代起已經(jīng)得到了長足的發(fā)展，近幾年的發(fā)展更是日新月異。作為重要的β-內(nèi)酰胺類抗生素，頭孢菌素類抗生素已經(jīng)由第一代發(fā)展到現(xiàn)在的第四代。20世紀(jì)70年代初7α-甲氧頭孢菌素被發(fā)現(xiàn)，這標(biāo)志著對β-內(nèi)酰胺類藥物的研究已經(jīng)進(jìn)入了新的紀(jì)元。

甲氧基頭孢菌素是指棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)發(fā)酵產(chǎn)生的頭霉素C(Cephamycin?C)經(jīng)半合成制得的一類以頭孢烯為母核，在β-內(nèi)酰胺環(huán)上的C7位有一個(gè)反式甲氧基的頭孢菌素。這類抗生素又稱頭霉素類抗生素(Cephamycins)。甲氧基的存在阻止內(nèi)酰胺環(huán)與酶分子的接近，增強(qiáng)藥物對β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性，并提高對厭氧菌的活性，使本類抗生素具有較強(qiáng)的耐β-內(nèi)酰胺酶性能，對一些產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌作用。由于結(jié)構(gòu)上的差異，它比頭孢菌素C的活性高，與其他頭孢菌素相比，其優(yōu)點(diǎn)尤為顯著。

甲氧基頭孢菌素已有多種產(chǎn)品上市，包括頭孢米諾、頭孢美唑等。這類藥物共同的半合成中間體為甲氧基頭孢菌素。甲氧基頭孢菌素的合成一般可以通過化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)化法。化學(xué)法是目前業(yè)內(nèi)普遍采用的方法，存在有機(jī)溶媒使用量大，能耗嚴(yán)重等問題。文獻(xiàn)報(bào)道利用棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus，ATCC27064)的粗酶液能夠?qū)㈩^孢菌素C轉(zhuǎn)化為甲氧基頭孢菌素C，但轉(zhuǎn)化率較低。我們通過倍增棒狀鏈霉菌中的cmcJ基因，試圖提高轉(zhuǎn)化頭孢菌素C生成甲氧基頭孢菌素的效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為甲氧基頭孢菌素C菌株轉(zhuǎn)化效率低的問題，提供轉(zhuǎn)化頭孢菌素C的效率更高的基因工程菌及其制備方法。

頭孢菌素C轉(zhuǎn)化為甲氧基頭孢菌素C的過程中，頭孢菌素C首先被羥基化酶轉(zhuǎn)化為羥基化頭孢菌素C，再由甲基化酶轉(zhuǎn)化為甲氧基頭孢菌素C，但是野生型的棒狀鏈霉菌對于頭霉素C的轉(zhuǎn)化效率較低。因此，本發(fā)明將轉(zhuǎn)化過程中的一個(gè)關(guān)鍵基因cmcJ，作為外源基因插入棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)野生型菌株的基因組中，并使它高效表達(dá)，發(fā)現(xiàn)得到的棒狀鏈霉菌突變株對于甲氧基頭孢菌素C轉(zhuǎn)化效率有所提高，同時(shí)中間產(chǎn)物羥基化頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化率提高更為顯著，可見cmcJ基因成功插入到棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)的染色體上并得到表達(dá)，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)化頭孢菌素C的基因工程菌，其是在棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)野生菌株的基因組中整合有轉(zhuǎn)化頭孢菌素C的一個(gè)關(guān)鍵基因cmcJ的表達(dá)盒的工程菌，所克隆的cmcJ基因的核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO.2的第1203-2271位所示的序列，其中cmcJ基因的編碼序列是SEQ?ID?NO.2的第1257-2189位所示的序列。

在基因組中整合入外源基因的表達(dá)盒，從而使插入的外源基因表達(dá)是現(xiàn)有技術(shù)，一般是讓該外源基因用啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，終止子終止轉(zhuǎn)錄即可。本發(fā)明中整合了含有紅霉素抗性基因啟動(dòng)子和cmcJ基因編碼序列的表達(dá)盒。

啟動(dòng)子可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而使基因表達(dá)。強(qiáng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率更高。因此，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的啟動(dòng)子可以采用現(xiàn)有技術(shù)中任何可以在棒狀鏈霉菌中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，優(yōu)選紅霉素抗性基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO.1第1-469位所示的序列。

根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的cmcJ基因是來源于棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)。

根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的基因表達(dá)盒在棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)野生菌株的基因組中的整合位點(diǎn)是attB位點(diǎn)。

本發(fā)明中，所述的棒狀鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)野生菌株可以是任何Streptomyces?clavuligerus屬的野生菌株，都可以達(dá)到本發(fā)明的效果，優(yōu)選棒狀鏈霉菌Streptomyces?clavuligerus?ATCC27064。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組載體，其含有紅霉素抗性基因啟動(dòng)子和cmcJ基因編碼序列的表達(dá)盒。