[發明專利]三種菌的三重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法有效
| 申請號: | 201210141228.3 | 申請日: | 2012-05-08 |
| 公開(公告)號: | CN102747144A | 公開(公告)日: | 2012-10-24 |
| 發明(設計)人: | 許龍巖;袁慕云;曹際娟;柯碧霞;相大鵬;鄒志飛;謝力 | 申請(專利權)人: | 許龍巖;袁慕云;曹際娟;柯碧霞;相大鵬;鄒志飛 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/42 |
| 代理公司: | 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001 | 代理人: | 劉明星 |
| 地址: | 510623 廣東省廣州*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 三種菌 三重 實時 熒光 pcr 檢測 引物 探針 試劑盒 方法 | ||
1.一種沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測引物,其特征在于,所述的檢測引物如下所示:
針對aceA基因:
5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`;
5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`;
針對腸炎沙門氏菌特異序列:
5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`;
5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`;
針對鼠傷寒沙門氏菌STM4599序列:
5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`;
5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`。
2.一種沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測探針,其特征在于,所述的檢測探針如下所示:
aceA基因的探針:5`-TGGCAGGAGAAGTACCCACAGG-3`;
腸炎沙門氏菌特異序列的探針:5`-CTGGCGAATGGTGAGCAGACAAC-3`;
鼠傷寒沙門氏菌STM4599序列的探針:5`-CGGGATTAATGTGCACTCCGGTTGTA-3`;
探針的5`端標記有熒光報告基團,3`端標記有熒光淬滅基團,三探針的5`端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。
3.根據權利要求2所述的沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測探針,其特征在于,所述的熒光報告基因為FAM、VIC或cy5,所述的熒光淬滅基團為TAMARA或BHQ2。
4.一種沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測試劑盒,包括實時熒光PCR反應液、UNG酶、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針,其特征在于,所述的檢測引物包括三對:
(1)針對aceA基因:
5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`;
5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`;
(2)針對腸炎沙門氏菌特異序列:
5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`;
5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`;
(3)針對鼠傷寒沙門氏菌STM4599序列:
5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`;
5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`;
所述的檢測探針包括:
(1)aceA基因的探針:5`-TGGCAGGAGAAGTACCCACAGG-3`;
(2)腸炎沙門氏菌特異序列的探針:5`-CTGGCGAATGGTGAGCAGACAAC-3`;
(3)鼠傷寒沙門氏菌STM4599序列的探針:
5`-CGGGATTAATGTGCACTCCGGTTGTA-3`;
探針的5`端標記有熒光報告基團,3`端標記有熒光淬滅基團,三探針的5`端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。
5.一種沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌三重實時熒光PCR檢測方法,用于檢測食品或海產品,其特征在于,包括以下步驟:
(1)對樣品進行增菌培養,提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板;
(2)使用權利要求1所述的針對aceA基因、腸炎沙門氏菌特異序列和鼠傷寒沙門氏菌STM4599序列的檢測引物及權利要求2所述的檢測探針,與實時熒光PCR擴增用的反應液、UNG酶及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應體系;
(3)將擴增反應體系在熒光PCR儀上進行實時熒光PCR反應,反應結束后,根據探針標記的熒光報告基團記錄的熒光信號,讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數(Ct);
(4)根據各樣品的Ct值,按照建立的標準曲線,判斷樣品中是否含有沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及鼠傷寒沙門氏菌。
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