技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性的試劑盒及方法。

背景技術

阿爾茨海默病（Alzheimier’s?disease，AD）是一種常見的神經系統退行性疾病，是最常見的癡呆類型，發病隱匿，病情呈進行性。目前發病機制尚不清楚，可能與遺傳和環境因素有關。ApoE編碼膽固醇代謝的關鍵載脂蛋E，通過調控和加速Aβ蛋白代謝、以及直接通過ApoE受體調控腦部脂質代謝和突觸功能，在AD的發病中起到重要作用。

根據ApoE表型提出ApoE基因模型，認為ApoE的合成是由位于一個基因位點上的三個等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一個等位基因對應于一個主要異構體產生三種純合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六種常見表型。ApoE3/3型又稱野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交換決定了異構體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg；E2都是Cys；112位為Cys和158位是Arg者為ApoE3異構體。自然人群中，基因頻率ε3分布最高，ApoE3/3表型分布約70%。

ApoE突變后，其與LDL-R的親和力發生改變。攜帶一個E4等位基因的個體其發展為AD的可能性高于無E4等位基因的個體約3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大約為15%，而在AD患者中的比例可達40%。ApoE4?是AD的重要危險因素。通過檢測ApoE的基因型，可了解是否為AD易感人群，繼而從病因學延緩AD的發生、發展；并定期檢查，以便早診斷、早治療、最大程度的降低疾病造成的損害。

綜上所述，ApoE基因多態性與AD發病顯著相關，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測ApoE基因多態性的試劑盒將為AD的預測起到積極的推動作用。

焦磷酸測序(Pyro?sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容

ApoE基因多態性是與AD發病顯著相關，ApoE是AD發生的主要易感基因之一。本發明提供一種檢測AD易感基因ApoE基因多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測ApoE基因多肽性。

????為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

一種焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性的試劑盒，包括如下引物：

（1）擴增引物：?

????ApoE?(rs429358)上游引物：5′-AGA?ACT?GGA?GGA?ACA?ACT?GAC?C-3′（SEQ?ID?NO.3）；

????ApoE?(rs7412)?上游引物：5′-?AGA?ACT?GGA?GGA?ACA?ACT?GAC?C?-3′（SEQ?ID?NO.3）；

????ApoE?(rs429358)下游引物：5′-CCC?CGG?CCT?GGT?ACA?CTG-3′（SEQ?ID?NO.4）；

????ApoE?(rs7412)下游引物：5′-?CCC?CGG?CCT?GGT?ACA?CTG-3′（SEQ?ID?NO.4）；

????其中，下游引物的5′進行生物素標記；

（2）測序引物：

ApoE?(rs429358)測序引物：5′-?GAC?ATG?GAG?GAC?GTG?-3′（SEQ?ID?NO.5）；

????ApoE?(rs7412)測序引物：5′-?CCG?ATG?ACC?TGC?AGA?-3′（SEQ?ID?NO.6）；

試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。

一種應用上述試劑盒檢測ApoE基因多態性的方法，包括如下步驟：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶鏈反應：