[發明專利]一種二點委夜蛾的分子鑒定方法有效
| 申請號: | 201210101254.3 | 申請日: | 2012-04-10 |
| 公開(公告)號: | CN102605093A | 公開(公告)日: | 2012-07-25 |
| 發明(設計)人: | 朱彥彬;李志勇;白輝;董立;馬繼芳;李立濤;劉磊;董志平 | 申請(專利權)人: | 董志平 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司: | 暫無信息 | 代理人: | 暫無信息 |
| 地址: | 050035 河北省石家莊市*** | 國省代碼: | 河北;13 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 二點委 夜蛾 分子 鑒定 方法 | ||
1.一種二點委夜蛾種類的分子鑒定方法,其特征在于包括如下步驟:
(1)?收集昆蟲樣本:采集的樣品放于95%乙醇中,-20℃保存;
(2)基因組DNA的提取:按照動物組織/細胞基因組快速提取試劑盒提取昆蟲基因組DNA,保存于-20℃備用;
(3)COI基因的擴增、克隆、測序及序列分析,其中COI?基因序列的PCR?擴增引物:?上游引物/下游引物5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3;
(4)測序結果表明ZB1~ZB17為二點委夜蛾不同單倍型,與ZB1(JQ395055)相似度均達到99%以上。
2.根據權利要求1所述的二點委夜蛾種類的分子鑒定方法,其特征在于COI基因擴增的具體步驟為:
20μL的PCR反應體系:PCR擴增總反應體系為20μL,其中模板DNA?2.0μL、上下游引物各1μL(濃度10μM)、10×PCR?buffer?2.0μL、dNTP?1.6μL(2.?5?mM)、酶?0.3U、超純水補足;
反應程序:94℃、5min;35個循環(94℃、45s,54℃、45s,72℃、1min);72℃延伸5min;用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,并回收目的條帶。
3.根據權利要求2所述的二點委夜蛾種類的分子鑒定方法,其特征在于
按照TaKaRa試劑盒上的步驟把切膠回收的PCR產物與PMD19-T載體連接,把陽性克隆的菌液測序。
4.根據權利要求3所述的二點委夜蛾種類的分子鑒定方法,其特征在于:?
先利用Sequencher_v4.1.4軟件讀取測序的序列,觀察峰值進行反復校對,利用DNAMAN_v6、ClustalX1.81軟件對測得的序列與JQ395055所示的序列進行多序列同源比對;此外,根據MEGA5.05建樹模型,以夜蛾科的小地老虎(Agrotis?ipsilon)COI基因做為外群,用鄰近法構建單倍型系統樹,并利用p-distance計算各單倍型之間的遺傳距離;結果表明與JQ395055相似度高達99%以上的即可認為該昆蟲為二點委夜蛾。
5.將權利要求1所述的方法用于快速區分鑒別二點委夜蛾的用途。
6.一種用于鑒定二點委夜蛾種類的引物,其特征在于序列為:5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAATCA-3。
7.將權利要求5所述的引物用于鑒定二點委夜蛾種類的用途。
8.一種包含權利要求5所述引物的試劑盒。
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