技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種霍山石斛微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱作短串連重復(fù)(Short?Tandem?Repeats，STRs)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple?Sequence?Repeat，SSRs)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)。是指一類遍布于生物基因組中的由幾個(gè)核苷酸對(duì)(稱為核心序列，一般為1～6bps)為重復(fù)單位組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)。其重復(fù)次數(shù)在同一物種不同的遺傳型間是高度可變的，但這段重復(fù)的兩端卻是相對(duì)保守的單拷貝序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，即可通過PCR技術(shù)分析核心序列重復(fù)次數(shù)的變異，在不同的遺傳型間檢測(cè)到多態(tài)。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成，微衛(wèi)星DNA序列被分為3種類型：?jiǎn)我恍?pure)，復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)。例如：

單一型：ATATATATATATATATATATATAT

復(fù)合型：ATATATCACACACACACACAC

間斷型：ATATATCA?ATATATCA?ATATATA

作為一種分子標(biāo)記，微衛(wèi)星DNA具有以下特點(diǎn)：廣泛分布于真核生物的基因組中，據(jù)估計(jì)每6kb長(zhǎng)度中就有1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)；核心序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性，多態(tài)性信息容量高：呈共顯性，遵循盂德爾法則遺傳；選擇中性等等。

基于以上特點(diǎn)，微衛(wèi)星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定和種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、輔助育種、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多樣性及物種進(jìn)化與親緣關(guān)系等方面的研究。

霍山石斛(Dendrobium?huoshanense.C.Z.Tang?et?S.J.Cheng)又名米斛，蘭科石斛屬植物，原產(chǎn)安徽霍山，是藥用石斛中的極品，并被譽(yù)為“中華仙草之最”。作為瀕危植物，霍山石斛現(xiàn)己被中國(guó)列入國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。

由于石斛是一種附生植物，對(duì)生態(tài)環(huán)境要求比較嚴(yán)格，自然繁殖頻率極低(＜5％)，加上長(zhǎng)期采集，野生植株已瀕臨滅絕。霍山石斛因其質(zhì)量上乘而馳名中外，多年來市場(chǎng)上霍山石斛有名無(wú)實(shí)，有價(jià)無(wú)市，資源接近枯竭?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上，凡冠以“霍山石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名稱的一些楓斗產(chǎn)品，均非用真正的霍山石斛加工而成，多數(shù)是銅皮石斛、鐵皮石斛、扁黃草石斛和鉤狀石斛的仿冒品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題：分離克隆霍山石斛的微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，建立霍山石斛微衛(wèi)星DNA技術(shù)體系并用這些分子標(biāo)記進(jìn)行霍山石斛遺傳多樣性，石斛屬植物遺傳關(guān)系的研究，以及進(jìn)行霍山石斛種質(zhì)鑒定。

本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案：霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，包括霍山石斛微衛(wèi)星(CT)n富集文庫(kù)的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序，得到51個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆。得到11個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57；Hs39為600個(gè)核苷酸，Hs40為694個(gè)核苷酸，Hs41為503個(gè)核苷酸，Hs42為638個(gè)核苷酸，Hs44為437個(gè)核苷酸，Hs47為704個(gè)核苷酸，Hs48為558個(gè)核苷酸，Hs50為540個(gè)核苷酸，Hs54為458個(gè)核苷酸，Hs56為509個(gè)核苷酸，Hs57為541個(gè)核苷酸。

附圖說明

圖1：Hs39位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖2：Hs40位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增20個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖3：Hs41位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖4：Hs42位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增28個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖5：Hs44位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖6：Hs47位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖7：Hs48位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖8：Hs50位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增31個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖9：Hs54位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增29個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。

圖10：Hs56位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。