技術領域

本發明屬于生物標志物領域，具體涉及原發性膽汁性肝硬化抗原標志物及其應用。

背景技術

原發性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝臟疾病，以肝內中小膽管的進行性破壞為主要特征，最終導致肝硬化和肝功能衰竭的一種疾病(Poupon，R?2010，Selmi，C.2011)。其病理學表現為匯管區炎癥，淋巴細胞圍繞受損的膽管周圍，并浸潤至膽管基底膜和膽管上皮細胞內，膽管上皮細胞呈空泡狀變性壞死，進而引起上皮樣組織細胞增生，形成肉芽腫，這種形態學特點提示膽管上皮是PBC免疫攻擊的目標。PBC最常見的臨床癥狀為乏力和皮膚瘙癢。與膽汁淤積有關的PBC特殊并發癥主要有骨質疏松、脂溶性纖維素缺乏、高脂血癥和脂肪瀉等。在疾病后期，可發生肝硬化和門脈高壓的一系列與其他原因導致的肝硬化所致者基本類似的并發癥，如腹水、食管胃底靜脈曲張破裂出血和肝性腦病等。

PBC最主要的血清生化指標就是血清堿性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰轉肽酶(Gamma-glutamyltransferase，γ-GT)升高，一般升高3-4倍，并且可見于疾病的早期和無癥狀期。但是谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)通常正?；蜉p度至中度升高。早期患者沒有黃疸，但隨著病情的進展，在較晚期的患者中血清膽紅素明顯升高，血清膽紅素水平有助于判定PBC患者的預后及決定肝移植的時機。高膽紅素、低白蛋白血癥和延長的凝血酶時間都是預后不良的指標。此外，PBC患者的血清膽汁酸水平通常會升高。

血清中存在抗線粒體抗體(AMA)是PBC的重要標志。AMA并非PBC唯一的特異性自身抗體，在PBC血清中亦可檢測到抗核抗體(ANA)，有呈現核模型(M-ANA)，有呈現多核點型(multiplenuclear?dots，MND)。此外，部分PBC患者表現有抗平滑肌抗體陽性、抗甲狀腺抗體、抗DNA抗體和類風濕因子等自身抗體。

自從醫學工作者發現某些疾病患者的血清呈現特異的免疫熒光染色模式后，探索這些自身抗體所針對的自身抗原以及建立相關檢測技術的工作就一直在進行。鑒定自身抗原方面，起初通過免疫熒光技術和細胞生物學知識初步確定靶抗原的細胞定位，再通過分離提取不同的細胞器，確認自身抗體識別的蛋白質在細胞中較精細的定位。隨著蛋白質電泳技術、免疫印跡技術及生物質譜技術的發展，越來越多的自身抗原被鑒定。近年來，隨著cDNA表達文庫技術以及高通量重組蛋白表達純化技術的運用，特別是高通量蛋白質芯片技術的發展，自身抗原的鑒定工作變得越來越簡單、方便和快捷。

另一方面，自身抗體的臨床實驗室檢測技術也取得了飛速發展，從起初的基于組織和/或細胞的免疫組織化學技術及免疫熒光技術，到傳統的沉淀反應、免疫電泳技術、凝集試驗、補體結合試驗技術等。隨著分子生物學的發展，特別是重組蛋白表達技術的發展，各種標記免疫測定技術(包括酶聯免疫測定技術、放射免疫技術、熒光免疫測定、化學發光免疫測定和金免疫技術等)已成為主要的免疫測定技術。此外，免疫印跡法也發揮了明顯的作用。近年來，隨著基因組學和蛋白質組學技術的發展，蛋白質芯片技術以其較高的檢測靈敏度在自身抗原鑒定方面發揮了重要作用，目前已有不少于21種蛋白質芯片用于臨床(Hartmann，M.，J?2009)，其中至少有5種經FDA認證批準用于自身免疫性疾病的診斷。

目前，自身抗原鑒定的方法主要包括以下五種：1)SEREX技術；2)噬菌體展示技術；3)SERPA技術；4)蛋白質芯片技術；5)MAPPing技術。其中SEREX技術、噬菌體展示技術需要構建表達文庫，經過數輪的生物淘洗，最終確定候選自身抗原的身份，程序繁瑣，耗時耗力。此外還存在以下缺點，1)篩選到的表位主要以大腸桿菌容易表達的線性表位為主；2)由于大部分的文庫是從腫瘤組織或細胞中提取mRNA制備cDNA的，表達文庫傾向于原本就是較高豐度的胞內蛋白，而自身抗體識別的自身抗原大部分都是表達量較低的蛋白質。

SERPA技術是伴隨中蛋白質組學技術的發展而產生的，在鑒定識別蛋白質翻譯后修飾自身抗體方面有獨特的優勢，并且也擺脫了構建表達文庫費時費力的工作，但是由于雙向電泳技術分離細胞全蛋白的能力所限，特別是極端分子量和等電點的蛋白質抗原的分離，以及電泳過程中天然蛋白質構象被破壞，篩選到的自身抗體仍然以識別線性表位為主。