技術領域：

本發明屬于分子生物學及分子檢驗領域的核酸擴增技術領域，具體涉及通過反義“死”寡核苷酸競爭非特異性模板來干擾引物聚合等非特異性擴增的技術領域。

背景技術：

核酸擴增技術起源于1971年，Korana首先提出核酸體外擴增設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。其思想種子進入到現代分子生物學發展的土壤就會生根、發芽。終于1983年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary?Mullis在研究核酸測序方法時產生了核酸擴增的靈感：于試管中模擬天然的DNA體內指數式復制過程。其基本原理：提供一種合適的條件---模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數地擴增已知兩端序列的一段DNA分子。經過一系列探索、發展和耐熱聚合酶、熱循環儀的發明、應用，Cetus公司于1987年申請了首個PCR發明專利(US?Patent?4,683,202)。

核酸擴增PCR反應由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：擬擴增的模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至54℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：升溫至72℃左右，DNA模板--引物結合物在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，尊循堿基反向配對與半保留復制原理，按5’-3’方向合成一條新的與模板DNA鏈反向互補的半保留復制鏈，不斷重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。一般PCR進行30個循環就能將待擴目的基因呈指數擴增放大數百萬倍以上，超過30個循環引物二聚體非特異性擴增就極劇增加。反應最終的DNA擴增量可用Y＝(1+X)ⁿ計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100％，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期PCR產物逐漸增加，進入一定循環后靶序列DNA片段的增加呈指數形式即對數期，隨著擴增產物的累積及PCR成份的消耗，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，達到“停滯效應”平臺期。

隨著1985-1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus?aquaticus)中提取到Taq耐熱DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐熱聚合酶的發現應用，PCR技術逐漸成熟、實用，并因其高靈敏度、操作簡便而快速傳播全世界，因而1989年稱為“PCR爆炸年”。PCR技術已成為生命科學領域最重要的核心基礎技術，Kary?Mullis也因此榮獲1993年諾貝爾化學獎。