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[發明專利]一種人血管內皮抑制肽的制備方法無效

專利信息
申請號: 201110448826.0 申請日: 2011-12-29
公開(公告)號: CN103183733A 公開(公告)日: 2013-07-03
發明(設計)人: 徐巖;李鄭武;王忠;高晶;李金花;宋紫玉;曹翊婕;李會成;王麗娜;黃宇紅;李曲亮;程廣偉 申請(專利權)人: 哈藥集團生物工程有限公司;哈藥集團技術中心
主分類號: C07K14/47 分類號: C07K14/47;C07K1/06;C07K1/04
代理公司: 暫無信息 代理人: 暫無信息
地址: 150025 黑龍江*** 國省代碼: 黑龍江;23
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摘要:
搜索關鍵詞: 一種 血管 內皮 抑制 制備 方法
【權利要求書】:

1.一種人血管內皮抑制肽:H-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Arg固相合成制備工藝,其特征在于所述方法包括如下順序步驟:⑴以Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂為原料依次連接以下保護基;⑵用去保護劑20%?PIP/DMF室溫處理;⑶加入裂解試劑;⑷過濾并洗滌;⑸純化;⑹濃縮。

2.根據權利要求1中步驟⑴,以Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂為原料,進行程序反應,依次連接以下保護基:Fmoc-Gly,Fmoc-Arg(Pbf),Fmoc-Asp(OtBu),Fmoc-Gly,Fmoc-Arg(Pbf),Fmoc-Met,Fmoc-Gly,Fmoc-Gly,Fmoc-Ser(tBu),Fmoc-Leu,Fmoc-Pro,Fmoc-Ser(tBu),Fmoc-Asn(Trt),Fmoc-Leu,Fmoc-Ala,Fmoc-Val,Fmoc-Leu,Fmoc-His(Trt),Fmoc-Leu,Fmoc-Val,Fmoc-Pro,Fmoc-Gln(Trt),Fmoc-Phe,Fmoc-Asp(OtBu),Fmoc-Arg(Pbf),Fmoc-His(Trt),Fmoc-Ser(tBu),Fmoc-His(Trt),得到Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Pro-Val-Leu-His(Trt)-Leu-Val-Ala-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Pro-Leu-Ser(tBu)-Gly-Gly-Met-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Wang樹脂;

程序反應如下:

(a)保護氨基酸預處理:取1~5當量的保護氨基酸,1~5當量的HOBt,用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解,DMF的用量為樹脂的體積的40~60%,再將溶液置于0℃~-10℃的水浴環境中攪拌冷卻30Min以上;另取等摩爾的DIC,再用DCM稀釋一倍,于0℃~-10℃水浴預冷,后將DIC溶液慢慢加入至保護氨基酸DMF溶解中,繼續冷卻攪拌反應60min以上,備用;

(b)脫保護基:用DMF溶劑使樹脂溶脹并洗滌,用去保護劑20%?PIP/DMF將樹脂預洗1次,再用去保護劑與樹脂反應25分鐘,脫去Fmoc-保護基;

(c)洗滌:用DMF洗滌2次,每次2min,DCM洗滌2次,每次2min,再用DMF洗滌2次,每次2min;

(d)連接保護氨基酸:加入處理后的保護氨基酸溶液進行縮合反應,縮合反應基本控制在3小時或3小時以上;

(e)洗滌:用DMF洗滌2次,每次2min,DCM洗滌2次,每次2min。

3.根據權利要求1中步驟⑵,用去保護劑20%?PIP/DMF室溫處理,得到His(Trt)-Ser(tBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Pro-Val-Leu-His(Trt)-Leu-Val-Ala-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Pro-Leu-Ser(tBu)-Gly-Gly-Met-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Wang樹脂。

4.根據權利要求1中步驟⑶,加入裂解試劑[TFA/水/三異丙基硅烷/1,2-二巰基乙醇=94:2:2:2(V/V)],一般為10~13ml/克肽樹脂,攪拌均勻,再加入干燥的肽樹脂,攪拌反應3-5小時,反應溫度20~30℃。

5.根據權利要求1中步驟⑷,過濾的濾液用少量TFA洗滌2次,合并濾液,30~35℃減壓濃縮至初始體積的30%得到濃縮液,加到-10℃無水乙醚(30ml/克肽樹脂),搖勻后在-10℃以下沉淀60分鐘,過濾收集沉淀,再用少量-10℃左右冷藏的無水乙醚洗滌兩次,轉移至干燥盤中,放置在風柜中揮干乙醚,得到肽的TFA鹽粗品。

6.根據權利要求1中步驟⑸,25~45%醋酸溶液溶解,濾膜過濾,采用高效液相色譜法進行純化,采用梯度洗脫收集主峰在30~40℃減壓濃縮,得到肽的TFA鹽。

7.根據權利要求1中步驟⑸,在小于40℃水浴條件下減壓濃縮,用旋轉蒸發儀蒸去大部分乙腈,得到CS8023醋酸鹽水溶液,凍干既得產品。

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