[發(fā)明專利]一種分析微藻代謝組的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201110384769.4 | 申請(qǐng)日: | 2011-11-28 |
| 公開(公告)號(hào): | CN102495152A | 公開(公告)日: | 2012-06-13 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 元英進(jìn);陸姝歡;丁明珠;牛艷紅 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 天津大學(xué) |
| 主分類號(hào): | G01N30/02 | 分類號(hào): | G01N30/02;G01N30/06 |
| 代理公司: | 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201 | 代理人: | 陸藝 |
| 地址: | 300072*** | 國(guó)省代碼: | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書: | 查看更多 | 說明書: | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 分析 代謝 方法 | ||
1.一種分析微藻代謝組的方法,其特征是包括如下步驟:
(1)微藻細(xì)胞收集及淬滅:
取出已培養(yǎng)好的微藻藻液樣品3-5份,每份100-150mL,4℃下3000-5000rpm,離心3-4min,收集下層的細(xì)胞,用3-5mL代謝終止液在-40℃下淬滅5-10分鐘,終止代謝反應(yīng),在-80℃下冷凍干燥4-6h獲得凍干細(xì)胞;
所述代謝終止液為含有1500mg·L-1NaNO3,36mg·L-1CaCl2·2H2O,75mg·L-1MgSO4·7H2O和40mg·L-1K2HPO4·3H2O的甲醇水溶液,所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1∶2;
(2)提取細(xì)胞內(nèi)代謝物:
從步驟(1)獲得的3-5份凍干細(xì)胞中各取15-25mg分別置于離心管中,每管加入1-2mL-40℃的代謝提取液,混勻,蓋緊并放入液氮中,反復(fù)凍融3-5次,在-20℃下4000-6000rpm離心1-2min,收集上清,另向殘?jiān)屑尤?.5-1mL代謝提取液,-20℃下4000-6000rpm離心1-2min,離心后,將兩次上清液合并,加入10-20μg氘標(biāo)記琥珀酸,得混合液,各取200μL混合液,在-80℃下冷凍干燥2-4小時(shí);
所述代謝提取液為體積百分含量為50%的甲醇水溶液;
(3)代謝物衍生化
向步驟(2)獲得的樣品中各加入20mg·mL-1的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液50μL,于40℃水浴中反應(yīng)60-80min,反應(yīng)結(jié)束后加入80μL?N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺,于40℃水浴再反應(yīng)60-80min,8000-12000rpm離心1min,取上清100μL放入已編號(hào)的GC進(jìn)樣瓶,室溫放置2h;
(4)GC-MS檢測(cè)
采用GC-MS對(duì)步驟(3)獲得的3-5份樣品進(jìn)行定性和定量處理,得到微藻代謝組分析結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析微藻代謝組的方法,其特征是所述微藻為小球藻(Chlorellasorokiniana)、柵藻(Scenedesmus?obliquus)、集胞藻(Synechocystis?sp.PCC6803)及魚腥藻(Anabaena?sp.PCC7120)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析微藻代謝組的方法,其特征是所述步驟(4)的檢測(cè)條件如下:
色譜柱:DB-5氣相色譜柱,其規(guī)格為30m*0.25mm,0.25μm;
進(jìn)樣量:1μL;
分流比:10∶1;
進(jìn)樣口溫度:280℃;
GC?interface溫度:270℃;
氦氣流速:恒壓,91KPa;
升溫程序:70℃保持2min,以5℃·min-1的速度升到290℃,并在290℃保持6min;
電離電壓:70eV;
源溫:250℃;
掃描范圍:50-800m/z;
掃描速度:2scan·s-1。
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