技術領域

本發(fā)明涉及水產養(yǎng)殖魚用滅活疫苗領域，具體涉及一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，同時還涉及一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，還涉及一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的用途。

背景技術

斑點叉尾鮰(Channel?catfish)于1984年從美國引進至我國養(yǎng)殖以來，由于其營養(yǎng)豐富、肉質鮮美，深受國內消費者的歡迎，逐漸成為我國水產品出口的主要品種之一，目前已在全國20多個省市養(yǎng)殖。隨著我國斑點叉尾鮰養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，集約化養(yǎng)殖程度的提高，疾病的危害也越來越大，特別是近年來不少地區(qū)魚種養(yǎng)殖場都發(fā)生了爆發(fā)性的出血病，死亡率高達90％以上，造成了重大的經濟損失。通過病原學研究發(fā)現(xiàn)，此病是由呼腸孤病毒引起。對于其防治措施，目前尚無有效藥物，疫苗免疫被公認為是最有效的預防措施。滅活疫苗由于其安全性好，目前已被廣泛應用于水產養(yǎng)殖中。然而傳統(tǒng)的滅活疫苗主要是采用福爾馬林滅活，由于福爾馬林對抗原成分有一定破壞作用，因而用其制備的滅活免疫效果較差且不穩(wěn)定。此外，其滅活時間長，福爾馬林使用量大，殘留毒性不易去除等缺點，限制了其大規(guī)模生產與應用。β丙內酯是一種雜環(huán)類化合物(C₃H₄O₂)，對病毒具有很強的滅活作用，其滅活機理為改變病毒基因組RNA的結構達到滅活目的。大劑量β丙內酯雖是一種致癌物，但極易水解，水解后形成人體脂肪代謝產物β-羥基丙酸，對魚體、人體無害。由于β丙內酯只作用于病毒RNA，對病毒蛋白無破壞作用，保持了抗原蛋白的完整性，所以β丙內酯滅活疫苗的免疫效果好。

目前尚未見到斑點叉尾鮰出血病疫苗的相關報道，本發(fā)明首次提供一種高效、安全、可規(guī)模生產的斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗及其制備方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗，該疫苗含有完整的病毒抗原蛋白，不含滅活劑，效價為10⁵TCID₅₀/ml，免疫效果好。

本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗的制備方法，該方法僅使用0.025％(V/V)的滅活劑β丙內酯于4℃滅活24小時即可達到完全滅活的目的。該方法簡單快捷，滅活徹底，并且不破壞抗原蛋白的完整性。

本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種斑點叉尾鮰出血病的滅活疫苗在制備治療或預防斑點叉尾鮰出血病藥物中的應用。應用該疫苗對斑點叉尾鮰魚種進行注射免疫時，其保護率達89％，浸泡免疫的保護率達72.6％。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施：

一種斑點叉尾鮰出血病滅活疫苗的制備方法，其步驟是：

A、CCK細胞培養(yǎng)：取液氮中保存的CCK細胞，37℃溫育2～3分鐘融化，加入含10％(V/V)小牛血清的MEM培養(yǎng)液(5ml/T₂₅培養(yǎng)瓶，pH7～7.5)，轉移至培養(yǎng)瓶中25～30℃培養(yǎng)。靜置6～8小時，待細胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液。在細胞培養(yǎng)2～3天，鋪滿培養(yǎng)瓶底后，采用0.1％～0.5％(W/V)的胰蛋白酶消化貼壁細胞，進行傳代培養(yǎng)。所述的MEM培養(yǎng)液為Sigma-aldrich或Gibco或其它公司生產的Eagle’s?MEM細胞培養(yǎng)液。

B、CCRV-730病毒培養(yǎng)與收獲：待CCK傳代細胞在瓶底鋪滿時，去掉培養(yǎng)液，然后按1/5的培養(yǎng)基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復數MOI(Multiplicity?ofinfection)為1～5PFU/cell，在病毒吸附細胞40～60分鐘后，補加含2％(V/V)小牛血清的MEM(pH7～7.5)維持液進行病毒增殖。在病毒感染48～72小時，細胞病變效應達80％時，收獲病毒，-80℃至室溫(20-25℃，以下相同)凍融3次，3000rpm，4℃，離心10分鐘，取上清再5000rpm，4℃，離心30分鐘以去除游離的細胞碎片，上清即為純化的CCRV-730病毒液。CCRV-730病毒液置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｋ龅腗EM培養(yǎng)液同步驟A一樣。

C、病毒滴度測定：將待測病毒液進行一系列10倍稀釋(10^-1～10^-10)，按上述病毒增殖方法在96孔板上感染CCK細胞。在病毒感染48～72小時，觀察細胞病變情況。按Reed-Muench法計算病毒滴度TCID₅₀。此病毒滴度即為滅活疫苗的效價。