技術(shù)領(lǐng)域??本發(fā)明涉及一種綜合改進(jìn)型的磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染試劑盒，試劑盒所包含的成分主要有：無菌水(組織培養(yǎng)級(jí)別)，PH梯度的HBS緩沖溶液組合，2M的氯化鈣。磷酸鈣沉淀介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。近些年來出現(xiàn)了很多類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，并且它們?cè)诓煌锓N的細(xì)胞系中表現(xiàn)出了高效的轉(zhuǎn)染效率。盡管如此，傳統(tǒng)的磷酸鈣沉淀法并沒有被淘汰，依然是很多生物實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)染首選。主要是由于磷酸鈣沉淀法有著用途廣泛，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染法成功的關(guān)鍵是磷酸鈣-DNA沉淀復(fù)合物的形成。而該復(fù)合物的形成又很大程度的依賴于HBS緩沖溶液的PH值。PH值的微小變化都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染效率。目前國內(nèi)的很多生物公司都推出了自己的磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染試劑盒，然而試劑盒中的HBS緩沖液PH值是固定的。由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間存在著條件的差異，不可避免的導(dǎo)致其在某些實(shí)驗(yàn)室可用，而換了其他實(shí)驗(yàn)室便不好用。本發(fā)明很好的解決了這個(gè)問題。通過提供PH梯度的HBS緩沖液組合，可以使用戶在實(shí)驗(yàn)的時(shí)候找到最佳的轉(zhuǎn)染條件，一旦條件找到，便可長期使用該條件進(jìn)行細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染。同時(shí)該試劑盒中還提供了0.4％的臺(tái)盼藍(lán)溶液，用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染過程中的細(xì)胞死亡情況，便于找到轉(zhuǎn)染效率與存活率都可觀的最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件。

背景技術(shù)??磷酸鈣沉淀細(xì)胞轉(zhuǎn)染法主要是通過形成磷酸鈣DNA沉淀復(fù)合物來達(dá)到將DNA輸送到體外培養(yǎng)細(xì)胞中的目的。普遍認(rèn)為該方法可以促進(jìn)DNA在細(xì)胞表面的附著，進(jìn)而通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用將外源DNA攝入。該方法被常規(guī)的用來進(jìn)行哺乳類細(xì)胞或昆蟲類細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。DNA首先與氯化鈣混合，然后將該溶液逐滴的加入一種磷酸緩沖溶液中，從而形成DNA-磷酸鈣沉淀。在滴加DNA溶液的過程中，不斷地在混合液中吹打?qū)ψ钸m沉淀的形成是很重的，因?yàn)槌蓤F(tuán)聚集的DNA是不利于粘附甚至進(jìn)入細(xì)胞的。除此之外，緩沖液的PH對(duì)于沉淀的形成也是至關(guān)重要的。找到形成最適沉淀的緩沖液的PH值對(duì)于各個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)者來說是細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

PH梯度磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染試劑盒，提供了PH梯度的HBS緩沖液組合。在首次實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者可以通過做平行實(shí)驗(yàn)，選出最佳PH的HBS緩沖液，作為以后實(shí)驗(yàn)的參考。由于PH梯度HBS緩沖液組合的存在，當(dāng)發(fā)現(xiàn)某一條件轉(zhuǎn)染效率不理想的時(shí)候，便可以重新通過平行實(shí)驗(yàn)來摸索條件。細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染復(fù)合物溶液的加入是會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的。該試劑盒中提供的臺(tái)盼藍(lán)溶液便于使用者在實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性，從而增多或者降低轉(zhuǎn)染復(fù)合的加入，最終總結(jié)出適合該實(shí)驗(yàn)室的某種細(xì)胞系的最佳轉(zhuǎn)染條件。

發(fā)明內(nèi)容??本發(fā)明的要點(diǎn)在于選擇如下配方：無菌水(組織培養(yǎng)級(jí)別)100ml，2?X?HBS緩沖液(7種PH)100ml，2M氯化鈣15ml，0.4％臺(tái)盼藍(lán)50ml，對(duì)照質(zhì)粒100ug。

7個(gè)PH梯度的2?X?HBS緩沖液是該發(fā)明的核心。2?X?HBS緩沖液各成分濃度如下：

4-羥乙基哌嗪乙磺酸(50mM/L)，

氯化鉀(10mM/L)，

葡萄糖(12mM/L)，

氯化鈉(280mM/L)，

磷酸鈉(1.5mM/L)。

PH值分別是7.01，7.03，7.05，7.07，7.10，7.15，7.2。配制完成后過濾除菌冷凍儲(chǔ)存。

2M氯化鈣配制完成后過濾除菌冷凍儲(chǔ)存。

0.4％臺(tái)盼藍(lán)可以用來顯示細(xì)胞的死活。死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加使該染料可以進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞染成藍(lán)色。

對(duì)照質(zhì)粒分別提供了可以在哺乳類細(xì)胞表達(dá)的綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒和可以在昆蟲細(xì)胞表達(dá)的綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒。滿足對(duì)于不同細(xì)胞系的檢測需求。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

(1)提供了不同PH值的HBS緩沖溶液，便于探索最佳轉(zhuǎn)染條件；

(2)可以在轉(zhuǎn)染的同時(shí)監(jiān)測細(xì)胞的生長狀況；

(3)提供了在不同物種細(xì)胞系中表達(dá)的對(duì)照質(zhì)粒，滿足了不同實(shí)驗(yàn)室的檢測需求。

具體實(shí)施方式??下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明：

以60mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)貼壁細(xì)胞為例：

第一天：準(zhǔn)備用來轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

按合適的濃度將細(xì)胞接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)板。在37攝氏度CO₂培養(yǎng)箱(哺乳類細(xì)胞)或25攝氏度培養(yǎng)箱(某些昆蟲細(xì)胞)中培養(yǎng)過夜。使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)的匯集度達(dá)到60％-90％為宜。

第二天：轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物：

1.取出一個(gè)EP管，標(biāo)上A。加入18ul?2M的氯化鈣和10ug對(duì)照質(zhì)粒，加水定容到150ul。