技術領域

一株東方伊薩酵母及其全細胞轉化產胞二磷膽堿的方法，涉及到胞二磷膽堿的制備，屬于生物制藥技術領域。

背景技術

胞二磷膽堿，又名胞磷膽堿，化學名稱是膽堿胞嘧啶-5’-二磷酸酯單納鹽，是卵磷脂生物合成的前體。補充外源性胞二磷膽堿即能激活卵磷脂的生物合成，?刺激腦干網狀結構的興奮，提高蘇醒閾值，恢復神經組織機能，改善腦代謝和神經傳導，提高患者的意識水平。此外，胞二磷膽堿還是一種重要的核酸藥物，能調節腦血管運動張力，改善大腦代謝功能。胞二磷膽堿作用的靶器官是肝臟和腦組織，臨床用以治療顱腦外傷及顱腦術后昏迷、帕金森氏綜合癥、遲發性運動障礙、神經性耳聾和耳鳴、腦血管疾病以及小腦與脊髓共濟失調。鑒于胞二磷膽堿的廣泛應用，其制備技術成為較受關注的研究課題。

胞二磷膽堿的生產方法有化學合成法、酶法和微生物轉化法，早在20世紀50年代就有報道通過化學法合成胞二磷膽堿，但化學合成的胞二磷膽堿產品不適合藥用，隨后采用酶促的方法合成胞二磷膽堿，但成本較高。目前常用的方法是微生物轉化法，但存在著轉化率、產量不高的問題。

微生物細胞轉化制備胞二磷膽堿主要是通過ATP的再生體系和胞二磷膽堿合成酶系。ATP的再生是通過糖酵解途徑(EMP)來實現，胞二磷膽堿合成酶系包括核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、膽堿激酶和磷酸膽堿胞苷轉移酶，ATP是胞二磷膽堿合成過程中磷酸供體。ATP的再生體系與胞二磷膽堿合成酶系偶聯時，反應體系中只需存在葡萄糖、磷酸鹽、5’-胞苷酸和磷酸膽堿即可合成胞二磷膽堿。因此，胞二磷膽堿的合成速率取決于ATP再生的速率、胞二磷膽堿合成酶系的速率以及二者偶聯的速率。

東方伊薩酵母(I.?orientalis)細胞中ATP的再生量取決于EMP途徑，而通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子等離子可以改變代謝流向，提高ATP的再生速率，從而與胞二磷膽堿酶系速率相匹配，實現高效制備胞二磷膽堿。

發明內容

本發明的目的是使用東方伊薩酵母(I.?orientalis)高效制備胞二磷膽堿。

本發明的思路是：以磷酸膽堿、5’-胞苷酸或其前體物質為底物，以葡萄糖為能量供體，通過無機鹽提高ATP再生速率，利用東方伊薩酵母(I.?orientalis)透性細胞制備胞二磷膽堿。

本發明主要包括以下四個方面：

(1)?胞二磷膽堿的制備是以磷酸膽堿、5’-胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，在水溶液中通過透性酵母細胞制備胞二磷膽堿。

(2)?上述(1)的制備方法中，所使用的酵母細胞為東方伊薩酵母(I.?orientalis)Z1，中國典型培養物保藏中心，菌種編號為：CCTCC?NO:M?2011272。

(3)?上述(1)的制備方法中，葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求，另一方面為胞二磷膽堿合成酶系提供ATP，本發明中通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合提高ATP的再生速率。

(4)?上述(1)的制備方法中，使用的酵母細胞經培養離心后得到的酵母全細胞，并在制備的水溶液中添加甲苯來提高細胞的透性，以提高胞二磷膽堿合成酶系的速率。

本發明的技術方案：一株東方伊薩酵母，其命名為東方伊薩酵母(Issatchenkia?orientalis)Z1，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO：M?2011272。

用所述東方伊薩酵母全細胞轉化產胞二磷膽堿的方法，以磷酸膽堿和5’-胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，通過添加無機離子提高ATP再生速率，利用東方伊薩酵母(I.?orientalis)?CCTCC?NO：M?2011272透性細胞制備胞二磷膽堿。

胞二磷膽堿的制備是在水溶液中進行，反應溫度為20~40oC，pH為4~9，反應時間為6~24h。