技術領域

本發(fā)明涉及一種化學修飾的聚乙二醇白介素15偶合物，屬于生物制藥領域。

背景技術

白細胞介素15(IL-15)是Grabstein等人于1994年發(fā)現(xiàn)的一種約為12-14kD的細胞因子，天然人白介素15成熟肽含有114個氨基酸，包括4個半胱氨酸殘基，Cys35與Cys85、Cys42與Cys88連接，形成的兩對分子內(nèi)二硫鍵對于保持IL-15的空間構象和生物學活性起重要作用。

與大多數(shù)細胞因子相似，IL-15可在機體正常的免疫應答中發(fā)揮作用，如促進T細胞、B細胞、自然殺傷（NK）細胞的發(fā)育等，IL-15還可對免疫系統(tǒng)外的多種組織和細胞發(fā)揮廣泛而多效的作用。體外研究顯示IL-15與IL-2由于共有的受體組分共有幾種生物學活性，在T細胞上存在的IL-15受體包括一種特有的α鏈，IL-15Rα，但是與IL-2R共有β鏈和γ鏈，結果，兩種受體都利用相同的Jak/STAT信號傳遞元件，不過，基于IL-2和IL-15及其受體的復雜調控和不同表達，已經(jīng)報道了體內(nèi)功能的顯著差異（Kirman等，1998；Waldmann?and?Tagaya，1999；Waldmann等，2001）。IL-15和IL-2的抗腫瘤效應應受到重視，比較IL-15與IL-2對肺腺癌轉移模型的療效時，它誘導的NK殺傷活性比IL-2誘導的高3-4倍，此外，6倍劑量的IL-15才能引起肺血管滲漏等毒副作用的出現(xiàn)，在大鼠的結腸癌模型中也發(fā)現(xiàn)，IL-15能顯著降低化療英氣的胃腸道毒性，增強藥物的最大耐受劑量。朱法良等（朱法良，孫汭，田志剛，等.?IL-15和rhIL-2誘生的LAK細胞特性比較.?中國免疫學雜志[J].?2002,18(4):252-258）在研究重組人白細胞介素15和重組人白介素2誘導的粘附性自然殺傷細胞（LAK）時發(fā)現(xiàn)，IL-15誘生的LAK細胞殺傷K562細胞的能力強于rhIL-2，同時，IL-15誘生的LAK細胞的CD3^-CD56⁺細胞、CD94⁺細胞百分率均要高于rhIL-2，證明IL-15在體內(nèi)對NK細胞功能可能具有較強的調節(jié)作用。

盡管，白介素15較白介素2有著更高的安全性及活性，作為蛋白類藥物，且由于其分子量較小，體內(nèi)應用后半衰期較短，因此臨床應用時，為維持其在體內(nèi)的有效血漿濃度，需要多次給藥，患者依從性較差。

為解決白介素15體內(nèi)半衰期短的問題，中國專利CN200410067182.0公開了一種人白介素15與Fc的融合蛋白，通過將Fc片段與白介素15連接，形成融合蛋白，在體內(nèi)可獲得更長的半衰期，但由于給藥時引入了外援蛋白或多肽片段，容易引起機體免疫反應。

其它治療蛋白的研究已經(jīng)表明，通過使蛋白質與聚合物例如聚乙二醇（PEG）綴合，通過治療蛋白和PEG兩者共價結合的連接部分可以顯著延長治療蛋白在血漿中的半衰期。

對于聚乙二醇分子來說，可通過多種方法將其加到蛋白質上。總的來說，聚乙二醇分子是通過一個在蛋白質分子上發(fā)現(xiàn)的反應基團而聯(lián)到蛋白質分子上。氨基，如賴氨酸殘疾上的或N-末端上的氨基通常用于這類附著，例如，Royer（US4002531）認為可利用還原性烷基化反應將聚乙二醇分子附著到酶上。Wright于1993年4月28日公開的EP0539167，“Peg?Imidates?and?Protein?Derivates?Thereof”中認為帶有自由氨基酸的肽及有機復合物可被PEG的直接衍生物或有關的水溶性有機多聚體所修飾。Shaw在1990年2月27日公開的美國專利號US4904584中涉及修飾蛋白質中用于通過反應性氨基基團附著聚乙二醇分子的賴氨酸殘疾的數(shù)目。

通常，這些偶聯(lián)物包括每個蛋白質分子結合的PEG分子數(shù)從0到蛋白質中氨基基團數(shù)變化的偶聯(lián)物，對于已經(jīng)單獨修飾的蛋白質分子，PEG單元可以結合在許多不同的胺位點上。

歐洲專利申請EP593868描述了PEG-IFN-α的制備，然而，PEG化反應不是位點特異性的，并因此獲得了PEG-IFN-α偶聯(lián)物位置異構體的混合物（也見Monkarsh等，ACS.?Symp.?Ser.，680:207-216,1997）。

Kinstler等在歐洲專利申請EP675201中演示了用mPEG-丙醛對巨核細胞生長和發(fā)育因子（MGDF）的N-末端殘基的選擇性修飾，這考慮到批次之間可重復性PEG化合物的代謝動力學。Gilbert等在美國專利5711944中證明能產(chǎn)生具有最適合水平；活性IFN-α的PEG化，在該例中需要費力的純化步驟來獲得最適偶聯(lián)物。