技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體為生物工程合成高藥用價值生物堿，是一種通過獲得轉化有三分三莨菪堿6β-羥化酶(H6H)基因的大腸桿菌重組菌株轉化合成高藥用價值東莨菪堿的方法。

背景技術

生物堿(Alkaloids)是中草藥中重要的有效成分之一，存在于生物體(主要為植物)中的一類含氮的堿性有機化合物，天然的生物堿具有生理活性較強包括莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿和樟柳堿。此類生物堿具有較強的抗膽堿生理活性，主要作用于副交感神經系統。其中莨菪堿和東莨菪堿都作為最普遍的抗膽堿藥物和解痙鎮痛劑被長期廣泛應用。但自然界中富含東莨菪堿的資源植物又比莨菪堿少，且在資源植物中的含量又比莨菪堿低，而東莨菪堿是藥理作用最強的一種中樞神經系統抑制劑，可用于阻斷副交感神經系統，對治療暈動癥，麻醉鎮痛、平喘止咳有效，目前在商用市場東莨菪堿的需求量是莨菪堿的10倍。因此，提高莨菪烷生物堿尤其是更具藥用價值的東莨菪堿的產量已經成為研究的熱點之一。

多年來，世界各國科學家圍繞著如何擴大莨菪烷生物堿的產量進行了大量的研究，如品質篩選、環境的調節，化學合成和細胞培養等，并取得一定的進展。由于傳統的育種方法所需的周期太長；化學合成的方法存在工藝流程復雜，成本高及造成環境污染等許多問題；植物細胞懸浮培養的方法則存在莨菪烷生物堿含量低及穩定性差等問題。因此，近年來隨著對莨菪烷生物堿代謝途徑的深入了解，體外生物催化技術快速成熟的發展，為人們利用此手段提高目標代謝物(東莨菪堿)開辟了一條嶄新的途徑。利用該技術，可以將莨菪烷生物堿合成途徑中的關鍵酶基因導入生物催化劑中，在體外進行生物化學反應，從而產生目標代謝物。

三分三莨菪堿6β-羥化酶(hyoscyamine?6β-hydroxylase，H6H，EC1.14.1.11)，是東莨菪堿合成途徑中的關鍵酶基因，屬于α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶家族。它介導兩步反應生成環氧化物，第一步催化莨菪堿的C-6位羥基化形成6β-羥基莨菪堿，進而又環氧化6β-羥基莨菪堿生成東莨菪堿(如圖1所示)。

由于大腸桿菌具有遺傳性狀了解透徹、生長快、培養經濟、表達水平高等特點，在蛋白工程技術領域成為首選的蛋白表達系統，因此大腸桿菌成為首選重組菌株。大腸桿菌所有B型菌株，如B834，BL21，BLR，Origami^TM?B，Rosetta^TM及Tuner^TM都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶(Grodberg?and?Dunn，1988)。因此，目的蛋白，即三分三莨菪堿6β-羥化酶，在這些菌株中的穩定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表達菌，因為其有利于蛋白的大量表達。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種催化合成東茛菪堿的方法，可有效提高產率，對緩解東莨菪堿藥源的緊缺性起到積極的促進作用。

本發明還提供了上述催化合成東茛菪堿的重組菌株。

本發明的技術方案為：

利用三分三莨菪堿6β-羥化酶基因轉化大腸桿菌而得到重組菌株。重組菌株含有重組載體，重組載體攜帶的外源基因為三分三莨菪堿6β-羥化酶基因。

重組菌株的宿主微生物選用編碼lon蛋白酶和ompt外膜蛋白酶的基因缺損的大腸桿菌，以減少三分三莨菪堿6β-羥化酶被降解的可能，提高三分三莨菪堿6β-羥化酶在宿主微生物中的穩定性。可使用的菌株包括所有大腸桿菌B型菌株，如B834、BL₂₁、BL₂₁(DE₃)或BLR等；優選地，使用能夠適合蛋白大量表達的菌株BL₂₁(DE₃)。

表達載體為原核表達載體，載體可以選用對三分三莨菪堿6β-羥化酶生物活性影響小的質粒系列，如pET系列、pQE系列、pGEX系列或pMAL系列等。優選地，使用pET30a質粒和pGEX4T-1質粒作為載體。

重組菌株的構建方法：

(1)制備帶有三分三莨菪堿6β-羥化酶基因的載體；

(2)使用步驟(1)中的產物獲得帶有三分三莨菪堿6β-羥化酶基因的原核表達載體；

(3)使用步驟(2)的終產物轉化大腸桿菌獲得重組菌株。

使用上述重組菌株，通過微生物轉化方法，以莨菪堿為底物，催化生成東莨菪堿。將底物莨菪堿與接種有重組菌株的培養基混合，使重組菌株表達的三分三莨菪堿6β-羥化酶蛋白能夠催化培養基中的外源添加的莨菪堿，生成東莨菪堿。