技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種甲酸脫氫酶，尤其涉及一種耐熱型甲酸脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法。

背景技術(shù)

甲酸脫氫酶?(formate?dehydrogenase，F(xiàn)DH，EC1.?2.?1.?2)?催化甲酸生成CO₂和H₂O，同時將NAD⁺還原為NADH。細菌來源的NAD⁺依賴型甲酸脫氫酶由2個相同的亞基組成，對甲酸和NAD⁺具有高度的專一性。甲酸脫氫酶主要應(yīng)用于輔酶NADH的酶耦聯(lián)法再生系統(tǒng)中。甲酸/甲酸脫氫酶再生體系具有以下優(yōu)點：1)?作為再生底物的甲酸價格低廉；2)?甲酸脫氫酶來源分布較廣，在細菌、真菌、植物中均有分布；3)?甲酸脫氫酶的催化產(chǎn)物CO₂易于從體系中去除，不會干擾目標(biāo)產(chǎn)物的分離；4)?反應(yīng)體系中低濃度甲酸不會影響其他酶活性。但是目前也存在著活性較低，熱穩(wěn)定性不好，酶價格昂貴等缺點，限制了其使用范圍。工業(yè)界唯一一例大規(guī)模生產(chǎn)過程中用到甲酸脫氫酶的即是德國Degussa公司利用來源于Candida?boidinii的FDH?生產(chǎn)?L-亮氨酸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種耐熱型甲酸脫氫酶基因及其編碼的多肽和制備方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種耐熱型甲酸脫氫酶基因，它具有SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列以及它的突變形式，所述突變類型包括：缺失、無義、插入、錯義。

一種上述耐熱型甲酸脫氫酶基因編碼的多肽，它具有SEQ?ID?No.2中的氨基酸序列。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明涉及Bacillus?sp.的耐熱型甲酸脫氫酶基因的分離及表達。以甲酸脫氫酶保守序列為基礎(chǔ)，克隆分離了耐熱型甲酸脫氫酶基因。該基因?qū)τ谥苽溆糜谏a(chǎn)耐熱型甲酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因微生物或動植物，并回收獲得該基因編碼的酶有用。

Bacillus?sp.保存于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號：CGMCC?No.4271，分類命名：芽孢桿菌（Bacillus?sp.）。

具體實施方式

首先，本發(fā)明提供了分離的，編碼耐熱型甲酸脫氫酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，該核苷酸分子是從Bacillus?sp.中分離到的，具有SEQ.?ID?NO.1的核苷酸序列，它編碼具有401個氨基酸的多肽，推測分子量為44.07?kDa。

本發(fā)明還涉及一種重組載體，該載體包含本發(fā)明的分離的核苷酸分子，以及包含有重組載體的宿主細胞。同時，本發(fā)明包括構(gòu)建該重組載體和宿主細胞的方法，以及用重組工程技術(shù)生產(chǎn)耐熱型甲酸脫氫酶的方法。

本發(fā)明進一步地提供了一種分離的耐熱型甲酸脫氫酶或多肽，具有SEQ.?ID?NO.2氨基酸序列，或至少70%相似，更佳地，至少具有90%，95%，99%的相同。

在本發(fā)明中，“分離的”DNA是指該DNA或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片斷已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。

在本發(fā)明中，“耐熱型甲酸脫氫酶基因”指編碼具有耐熱型甲酸脫氫酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ.?ID?NO.1的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指該序列中有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于公知的密碼子的簡并性，所以與SEQ?ID?NO.1核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ?ID?NO.2所述的氨基酸序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ?ID?NO.1核苷酸序列同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。

在本發(fā)明中，“分離的”蛋白的多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析，PAGE或HPLC法測量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組份。