技術領域：

本發明涉及一種魚類染色體熒光原位雜交方法，特別是一種靈敏度高、特異性強、定位準確，有利于分析多倍體魚類是遺傳多倍體，還是進化多倍體，以及是同源多倍體還是異源多倍體的魚類染色體熒光原位雜交方法。

背景技術：

在水產動物中，自然多倍體現象比較普遍。在中國已報道的淡水魚類核型中有多種魚發現了多倍體類型。多倍體魚類因其生長優勢、群體產量及抗病力等各方面都具有二倍體魚所無法比擬的優勢，因此，許多多倍體種類已成為重要的經濟魚類或重要的養殖對象。目前，關于魚類染色體數目和核型的研究已有相應文獻報道，如我國常見的泥鰍，李渝成(1987)和印杰(2005)等根據染色體的基本形態學特征對泥鰍染色體中期分裂相進行核型分析，二倍體泥鰍2n＝50，核型公式8m+6sm+36t，NF＝64；四倍體泥鰍4n＝100，核型公式16m+12sm+72t，NF＝128，類似的研究在我國廣布的鯉科寬鰭和鱧科的月鱧(李渝成1985)等，均有所報道。但由于缺少足夠的遺傳學證據，染色體核型分析通常只能以二倍體的形式排列，即不能分析出多倍體魚類是遺傳多倍體，還是進化多倍體，以及是同源多倍體還是異源多倍體。

熒光原位雜交(Fluorescence?in?situ?hybridization?FISH)是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術。FISH技術彌補了經典原位雜交和染色體帶型技術的不足，可以在分子水平上進行細胞遺傳學分析。它具有靈敏度高、特異性強、定位準確等優點，廣泛應用于基因診斷、基因組作圖和基因定位、核組成、染色體機構與功能、染色體進化、染色體鑒別等多個方面，已經成為分子細胞遺傳學發展最快的領域。FISH技術在人類及哺乳動物中已成功運用，但在魚類遺傳學研究中的應用還不夠深入廣泛，應用報道很少，如戢福云等人(2003)應用FISH技術證明黃鱔中存在Hsl基因；易梅生等人(2002)應用FISH技術將人類Y染色體長臂異染色質區與魚類基因組進行比較。迄今為止，關于FISH技術在魚類多倍體方面的應用未見報道。

發明內容：

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種靈敏度高、特異性強、定位準確，有利于分析多倍體魚類是遺傳多倍體，還是進化多倍體，以及是同源多倍體還是異源多倍體的魚類染色體熒光原位雜交方法。

本發明的技術解決方案是：一種魚類染色體熒光原位雜交方法，其特征在于依次按如下步驟進行：

a.制備染色體分散良好的染色體玻片標本，-80℃保存；

b.將染色體玻片標本于65℃恒溫干燥2小時，在4×SSC溶液中浸泡5min，取0.5mg/ml的RNase溶液100μL至染色體玻片標本上，用封口膜蓋上載玻片，放入底部放有2×SSC溶液的濕盒中37℃，30min；然后揭掉封口膜，將染色體玻片標本放入4×SSC溶液中浸泡5min，再轉入裝有卡諾固定液的染色缸中浸泡5min后取出、晾干；所述2×SSC溶液是DDW與20×SSC溶液體積比為9∶1的混合液，所述4×SSC溶液是DDW與20×SSC溶液體積比為4∶1的混合液；

c.以人的5.8S+28SrDNA為探針，用Biotin-16-dUTP標記該探針，探針標記混合液渦流振蕩混合輕離心后，15℃水浴120min，65℃10min，室溫放置10min后4℃冷藏；純化混合液與探針標記混合液按體積比為70.5∶20混合，-80℃靜置20min，室溫靜置10min，4℃15000rpm離心15min，加入150μL70％酒精輕離心，去掉上清液室溫干燥5min，加入去離子甲酰胺20μL，得純化后的探針混合液冷藏備用；所述探針標記混合液組成為：0.4mol/ml?dATP2μL，0.4mol/ml?dGTP2μL，0.4mol/ml?dCTP?2μL，10×buffer?2μL，1mol/ml?Biotin-16-dUTP?1μL，100μg/ml人的5.8S+28S?rDNA探針1μL，滅菌蒸餾水6.5μL，DNA聚合酶I和DNA酶混合液3.5μL；所述純化混合液是鮭魚精子DNA和E.coli體積比為1∶1的混合液2μl、4mol/ml的醋酸銨2.5μL及100％酒精66μL的混合液；

d.將c步驟冷藏備用的純化后的探針混合液在75℃的水浴鍋中10min，迅速置于冰盒中冷卻10min；