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[發明專利]用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素污染物生物模型及方法無效

專利信息
申請號: 201010276272.6 申請日: 2010-09-09
公開(公告)號: CN101982075A 公開(公告)日: 2011-03-02
發明(設計)人: 于源華;張昊;李金海;于化東;張淑華;姚健;宋禹;楊佳新;林銘燕;徐任 申請(專利權)人: 長春理工大學
主分類號: A01K67/033 分類號: A01K67/033
代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211 代理人: 紀尚
地址: 130022 吉林省長春市*** 國省代碼: 吉林;22
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摘要:
搜索關鍵詞: 秀麗 線蟲 建立 食品 飼料 中甾體類 激素 污染物 生物 模型 方法
【權利要求書】:

1.一種用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素污染物生物模型,其模型是:用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素污染物生物模型。

2.一種用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素污染物生物模型的方法,其方法是:

A、用秀麗線蟲建立甾體類激素純品生物模型

a、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液,將正在產卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩沖液從NGM培養板中洗下,1500rpm離心1min,棄去上清;如上法再用M9緩沖液清洗一次后將含秀麗線蟲的M9buffer溶液定容于容器內,并加入等體積裂解液,上下顛倒混勻3-5min后1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉淀;沉淀改用無菌的S-Medium反復清洗2-3次至pH值達到中性,此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好;將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于生化培養箱內16℃-25℃培養8-12h;由于沒有食物,蟲卵孵化以后會全部停止在秀麗線蟲幼蟲第一期,1500rpm離心3min收集幼蟲,備用;

b、將甾體類激素溶于體積百分濃度為1%的二甲基亞砜中;

C、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露于甾體類激素純品中

秀麗線蟲采用液體暴露方法進行暴露,設置兩組樣品,第一組為暴露組,用無菌的細胞培養板,每孔加入a步驟收集獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E.coli?OP50及液體NGM培養液及甾體類激素純品,并混勻,甾體類激素的終濃度為0.1ng/ml-20ng/ml;第二組為空白對照組,用無菌的細胞培養板,每孔加入a步驟收集獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E.coli?OP50及液體NGM培養液;將這兩組樣品放入生化培養箱16℃-25℃中暴露培養6h后分別用移液槍將樣品取出,置于離心管中;

d、分別向兩組樣品的離心管中加入M9緩沖液,搖勻后靜置10min,去上清液,再加入M9緩沖液,搖勻后靜置10min,再去上清液,再加入M9緩沖液搖勻;樣品中取出涂布于含有E.coli?OP50的NGM固體培養基上,在生化培養箱16℃-25℃中培養直到線蟲長到可以挑出的長度為止,將線蟲挑出,放入新的含有E.coli?OP50的NGM固體培養基上,生化培養箱16℃-25℃中培養,每隔一天將線蟲挑出到新的含E.coli?OP50NGM固體培養基上,直到產卵期結束;丟失的線蟲、因爬到培養皿壁而死亡的線蟲以及蟲袋應從統計數據中排除;采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對秀麗線蟲進行錄像,進行如下指標的測定

(1)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統的影響

(A)、從秀麗線蟲幼蟲第一期幼蟲到開始產卵時所需要的時間;

(B)、后代數目,后代數目即整個產卵期的所有卵數;

(C)、世代時間,P0代成蟲產卵到其F1代成蟲產卵的時間間隔;

(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響

(A)、頭部擺動頻率,將已發育為成蟲的線蟲挑入溶液中,經過1min的恢復,記錄線蟲在1min內頭部擺動的次數;

(B)、身體彎曲頻率,將已發育為成蟲的線蟲挑到一個沒有OP50的NGM培養基上,記錄下20s內身體彎曲的次數;

(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響

(A)、壽命,以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天,以用取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止;線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間;

(B)、體長的測定,線蟲身體僵直,無彎曲時的體長;

e、重復a、b、c、d步驟,并將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h,甾體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果;暴露18h,甾體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果;暴露24h,甾體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果;

f、采用軟件Origin7.5對數據進行顯著性分析,如果暴露后秀麗線蟲的生理指標與暴露前的生理指標具有顯著性差異,則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害;如果沒有顯著性差異,則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害;

B、用秀麗線蟲建立食品中甾體類激素生物模型

a、重復技術方案A中的步驟a獲得的同步化秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液;

b、將新鮮的實驗用食品清洗干凈,用手術刀切片,用濾紙濾干水分,置于均質器中絞成泥狀,置于離心管中,加入體積百分濃度為1%的二甲基亞砜中,用玻棒攪拌均勻,漩渦振蕩1min,置于55℃水浴中保溫20min,取出漩渦振蕩20min,以3000rpm離心20min,吸出上清液為甾體類激素提取液,并濃縮到濃度為80%以上;

c、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露于甾體類激素提取液中

秀麗線蟲采用液體暴露方法進行暴露,設置兩組樣品,第一組為暴露組,用無菌的細胞培養板,每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E.coli?OP50及液體NGM培養液及甾體類激素提取液,并混勻;第二組為空白對照組,用無菌的細胞培養板,每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E.coli?OP50及液體NGM培養液,將這兩組樣品放入生化培養箱16℃-25℃中暴露培養6h后分別用移液槍將樣品取出,置于離心管中;

d、重復技術方案A中的步驟d、f、e。

C、用秀麗線蟲建立飼料中甾體類激素生物模型

a、重復技術方案A中的步驟a獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液;

b、取飼料于具塞離心管中,加入氯仿,劇烈振搖并進行自然蒸發,再加入100%酒精溶解甾體化合物濃縮1000倍,取出上清溶液,為甾體類激素提取液;將所提取的液體放至于通風櫥內將其風干,用體積百分濃度為1%的二甲基亞砜溶解殘留物,并濃縮到濃度為80%以上;

c、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露于甾體類激素提取液中

秀麗線蟲采用液體暴露方法進行暴露,設置兩組樣品,第一組為暴露組,用無菌的細胞培養板,每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E.coliOP50及液體NGM培養液及甾體類激素提取液,并混勻;第二組為空白對照組,用無菌的細胞培養板,每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E.coli?OP50及液體NGM培養液,將這兩組樣品放入生化培養箱16℃-25℃中暴露培養6h后分別用移液槍將樣品取出,置于離心管中;

d、重復技術方案A中的步驟d、f、e。

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