技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種安莎霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高方法。

背景技術(shù)

安莎霉素(Ansamitocin)是珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema?pretiosum)產(chǎn)生的美登素衍生物，其母核為19-C的大環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)，C-3連接不同長(zhǎng)度的碳鏈，主要活性成份安莎霉素AP-3(AP-3)，其側(cè)鏈為異丁?；?，在低濃度下可抑制非白血性白血病細(xì)胞系及人類固體腫瘤。由于腸胃副效應(yīng)及神經(jīng)毒性，其研究還停留在臨床二階段。然而，由于Ansamitocin可在臨床一期中作為抗體毒素結(jié)合物及免疫結(jié)合物，有重要的應(yīng)用潛力。

安莎霉素的生物合成途徑共包括48個(gè)基因(分散在兩個(gè)基因簇)，其中asm2，8，18，29，31，34，39和asm40為調(diào)節(jié)基因；asm22-24和asm43-47負(fù)責(zé)安莎霉素起始單位的合成，asm13-17負(fù)責(zé)延伸單位methoxymalonyl-ACP的合成。研究表明，敲除或過表達(dá)asm2均能提高安莎霉素活性成份AP-3的產(chǎn)量，另外，過表達(dá)asm39也能有效地提高AP-3產(chǎn)量。敲除結(jié)構(gòu)基因asm14，15，19和asm24等檢測(cè)不到產(chǎn)物AP-3。在安莎霉素發(fā)酵方面，Bandi等報(bào)道了利用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化野生型和asm2突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基，最大AP-3產(chǎn)率分別為5mg/(L.d)和8.7mg/(L.d)。

目前，已報(bào)道的野生型珍貴橙色束絲放線菌產(chǎn)Ansamitocin主要為液體發(fā)酵，產(chǎn)量在12mg/L-60mg/L之間。

金屬離子對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)酵具有巨大的影響，參與生物體內(nèi)許多酶活力的調(diào)節(jié)，例如鎂離子是糖代謝過程中許多關(guān)鍵酶的輔因子。

經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前考慮提高AP-3的產(chǎn)量的方法主要集中在氮源和碳源，例如通過PB設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法及中心組合法優(yōu)化的氮源有蛋白胨和酵母粉，碳源有蔗糖和糊精。氮源是用來構(gòu)成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)，以及抗生素等含氮代謝產(chǎn)物。但是該技術(shù)成本高，培養(yǎng)基組分復(fù)雜，成分不確定，重復(fù)性差，且給研究機(jī)理帶來了困難，對(duì)后續(xù)分離提取帶來了很大的困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種安莎霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高方法，通過在培養(yǎng)基中添加鎂離子使安莎霉素的發(fā)酵產(chǎn)量獲得顯著提高。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟：

第一步、首先配置種子培養(yǎng)基，采用甘油融化接種于種子培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)操作，獲得一級(jí)種子，經(jīng)二次培養(yǎng)得到二級(jí)種子；

所述的種子培養(yǎng)基的組分及重量百分比為：酵母提取物0.4％、麥芽糖1％、葡萄糖0.4％，加入98.2％蒸餾水并攪拌后調(diào)節(jié)pH值為7.45。

所述的甘油融化接種是指按0.5％-1.0％接種量，采用-70℃保存的甘油管經(jīng)融化后融化接種于種子培養(yǎng)基。

所述的培養(yǎng)操作是指：在25-32℃環(huán)境下培養(yǎng)24-60h。

所述的二次培養(yǎng)是指：取一級(jí)種子按1.0-3.0％的接種量接種于種子培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)操作。

第二步、配置發(fā)酵培養(yǎng)基，并將二級(jí)種子進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)；

所述的配置發(fā)酵培養(yǎng)基是指：配取組分及質(zhì)量百分比分別為：酵母提取物1％、玉米粉濾液2％、葡萄糖0.5％、甘油4％、磷酸氫二鉀0.05％、七水和硫酸亞鐵0.0002％以及碳酸鈣0.5％，加入91.498％蒸餾水并攪拌后調(diào)節(jié)pH值為7.45。

所述的搖瓶培養(yǎng)是指：將二級(jí)種子按1.0-3.0％接種量接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶中。

第三步、將濃度為1M的硫酸鎂水溶液添加至發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵處理，然后將發(fā)酵搖瓶經(jīng)搖床培養(yǎng)后實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)。

所述的發(fā)酵處理是指：發(fā)酵后的發(fā)酵搖瓶中鎂離子濃度為0.1-20mM。

所述的搖床培養(yǎng)是指：將發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)入搖床并在25-32℃，150-300rpm條件下培養(yǎng)5-12天。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，發(fā)酵水平高，已明顯超過原工藝的水平；操作簡(jiǎn)單且成本低，便于大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例中以玉米粉濾液為碳源的效果示意圖。

圖2為實(shí)施例中以蕎麥粉濾液為碳源的效果示意圖。

圖3為實(shí)施例中以玉米粉濾液為碳源的效果比較圖。

圖4為實(shí)施例中以蕎麥粉濾液為碳源的效果比較圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1