技術領域

本發明涉及一種酶電極的制備方法，及將該酶電極用于水中污染物檢測的電化學檢測領域。具體涉及一種用于檢測水中污染物的酶電極的制作方法以及將所制備的酶電極應用于水中低濃度氯酚類物質的檢測。

背景技術

固定化酶傳感器集酶反應的專一性、固定化酶的長期穩定性、電化學分析快速靈敏的特點于一體，正日益引起人們的關注，許多有理論意義和實用價值的酶電極正在不斷被開發出來。其在環境中的應用主要是對于酚類物質的檢測。90年代就有學者使用漆酶和酪氨酸酶雙酶體系修飾的玻碳電極共同用于酚類化合物的連續流分析。隨后，有研究報道酪氨酸酶通過交聯法被固定于3-巰基丙酸自組合單層膜上制備的酶電極可在連續流模式下同時測定10種酚類化合物。Wang和Hasebe使用八種交聯劑將酪氨酸酶共價固定在氨基化的碳電極表面，其中戊二醛交聯方法顯示出好的靈敏度，操作穩定性以及儲存穩定性，并且此法應用于兒茶酚和4-氯酚的檢測顯示出低的檢測限以及重復利用性。Jarosz-Wilkolazka等研究發現基于來源于C.unicolor的漆酶修飾電極制備的生物傳感器對于兒茶酚濃度的動力學變化響應迅速，可以被很好的應用于連續流模式下檢測酚類化合物。Korkut等在不使用交聯劑的情況下通過電聚合過程將辣根過氧化物酶固定于碳納米管/聚吡咯納米生物材料修飾的電極上，研究了生物傳感器對18種酚類衍生物的線性范圍、靈敏度和檢測限，發現生物傳感器對所測試的這些酚類衍生物都具有低的檢測限，并且響應時間快(小于2s)。

目前，傳統的酶固定化方法主要有：吸附法、共價結合法、交聯法和包埋法。吸附固定是最簡單的方法，是通過氫鍵、疏水鍵和π-電子親和力等物理作用力將酶直接固定于不溶性載體上的一種固定化方法。此方法具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結構變化少的優點，但這種方法負載的酶與載體相互作用力弱、酶易脫落。共價結合時通過對電極進行化學修飾，再利用酶蛋白分子中可以進行結合的-NH、-OH、-SH、-COOH等活性基團與電極表面上的反應基團之間形成共價鍵連接。此法制備的酶電極響應速度快、穩定性好，酶與載體之間的連接很牢固，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落，利于連續使用。但由于采用了比較激烈的反應條件，從而不能得到比活力高的固定化酶。包埋法是指將聚合物的單體和酶溶液混合后，借助聚合促進劑(包括交聯劑)的作用使單體進行聚合，從而將酶包埋于聚合物中的固定化方法。此法對大分子底物不適用，且儲存穩定性和熱穩定性差。交聯法即利用雙功能或多功能試劑在酶分子之間或酶分子與載體間進行交聯反應，以共價鍵制備固定化酶。此法操作簡便，但酶回收率不高。

靜電紡絲技術是一種應用高壓電使帶電荷的高分子溶液或熔體在靜電場中流動或變形，然后由于溶劑蒸發或熔體冷卻而固化，最終產生直徑數十納米到幾十毫米的均勻纖維的過程。靜電紡絲納米纖維膜由于具有大的比表面積、高孔隙率和高吸附性能而被認為是一種較為理想的酶固定化載體。迄今為止，兩種主要的方法被用于通過靜電紡絲將酶和聚合物形成納米纖維。一種方法是將酶后固定在電紡納米纖維的表面。另一種方法是直接將酶與不同聚合物溶液進行混合，一同進行靜電紡絲，即本發明中所涉及的原位電紡。這種方法可以使保護酶分子免受極端條件限制的纖維內部空間的優勢得到充分發揮，從而提高酶活。通過原位靜電紡絲的方法固定化漆酶構筑生物傳感器用于污染物的檢測尚未見文獻報道。因此，通過原位靜電紡絲的方法制備固定有酶的超細纖維在生物傳感器的制備方面將有很現實的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過靜電紡絲技術直接將漆酶固定于電極表面從而能高效、穩定檢測環境中氯酚類物質的方法。本發明所提供的酶電極的制備方法條件溫和，簡單易行，穩定性好，特別利于快速安置，并且運用此法制備的漆酶電極對氯酚類物質的檢測具有靈敏、穩定、準確的優點。

1.本發明的第一方面，涉及一種靜電紡絲固定化酶電極的制備方法，具體包括下列步驟：

1)電極的預處理：

玻碳電極表面先經金剛砂紙粗研細磨后，再用粒徑0.05μm的α-Al₂O₃粉在平板玻璃上進行拋光，每次拋光后先洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2～3min，重復三次，直至清洗干凈；最后用乙醇、V_硝酸∶V_水為1∶1的硝酸和水徹底洗滌，得到新鮮的電極表面，而后置于0.2mol/L?H₂SO₄中經循環伏安掃描至穩定；

2)原料溶液的配制：