技術領域

本發明涉及藥用植物育種領域，具體來說，涉及一種珍稀民族藥天山雪蓮同源四倍體植株的培育方法。

背景技術

天山雪蓮(Saussurea?involucrata?Kar?et?Kir.)系菊科鳳毛菊屬多年生一次性開花結實大型草本植物，又名雪蓮花或荷蓮，是國家三級瀕危保護種、新疆特有分布種。生長于海拔2400～4100m處的亞高山和高山懸崖陡壁之上、冰漬巖縫之中。為新疆特有的珍奇名貴中草藥和高山花卉，具有重要的藥用和觀賞價值。雪蓮耐低溫、抗風寒，生長環境極為嚴酷、自然繁殖率低(野生環境下，種子萌發率不到5％)、生長周期長且人工栽培困難。目前，適宜雪蓮生存的種群分布范圍也隨著全球氣候變暖而日益縮小，人為的過度濫挖亂采，致使野生雪蓮資源日益匱乏，物種瀕臨滅絕。

天山雪蓮生長期長達5～8年，根、莖、葉富含具有藥用活性的次生代謝產物如生物堿、黃酮類、揮發油、內脂、甾體類、多糖等，其花蕾更富含微量元素和氨基酸等，具有活血通絡、散寒除濕、抗炎鎮痛、抗疲勞、終止妊娠以及滋陰壯陽等功效。多倍體植物由于染色體加倍，往往具有器官的巨大性，即根莖葉的產量較高，能較好地滿足藥材生產的要求；另一方面，植物染色體倍性的變化，也往往會導致次生代謝產物含量的變化，有可能獲得有效成分含量高的藥用植物。同時多倍體植株生態適應性及對逆境的抗性也有所增強。近年來，對天山雪蓮的研究大多集中在生理、有效藥用成分、藥理以及基因工程等方面，關于其多倍體育種卻研究甚少。因此，從根本上解決藥用植物天山雪蓮的品種選育，不僅對于促進人工道地性種植產業的推廣和發展，而且對于高山瀕危藥用植物的保護、開發和利用都具有非常重要的意義。

單倍體是指體細胞中含有本物種配子染色體數的生物個體。而一倍體是指體細胞含一個染色體組的個體。絕大多數生物為二倍體生物，其單倍體的體細胞中含一個染色體組，如果原物種本身為多倍體，那么它的單倍體的體細胞中含有的染色體組數一定多于一個。如四倍體水稻的單倍體含兩個染色體組，六倍體小麥的單倍體含三個染色體組。多倍體就是指體細胞中含有三個以上染色體組的生物個體。同源多倍體是由原來的染色體組加倍形成的多倍體。鑒于此，在進行同源四倍體天山雪蓮植株的培育過程中，就要確實保證細胞內的染色體數呈整數加倍，而不是單單指染色體數的簡單增多，否則得到的多倍體只是雜合體(染色體數不規律增加)或嵌合體(含有不同倍性的各種細胞)，而且此類多倍體在繼代增殖過程中往往會發生回復突變，且性狀不穩定。為了得到純合同源四倍體天山雪蓮植株，本發明在2007100089255.X基礎上進行了大幅度改進。在優化種子表面消毒方法、四倍體植株誘導條件特別是處理溫度及后期增殖溫度的嚴格控制、改用莖尖生長點為材料進行染色體壓片、利用先進準確的DNA含量流式細胞儀檢測技術等方面做了細化和改進，并成功實現組培四倍體植株的溫室移栽，通過大量實驗摸索出了一套培育純合同源四倍體天山雪蓮植株的實驗方法。

此外，本發明還結合雪蓮無菌苗快速誘導叢生芽與增殖技術，利用秋水仙素處理下胚軸莖段使再生植株染色體加倍，誘導產生四倍體天山雪蓮植株，結合形態學、解剖學、染色體壓片以及流式細胞儀技術篩選鑒定具有優良性狀且生物量和藥用成分均有所提高的四倍體植株。可以克服天山雪蓮在自然繁殖和人工種植中出現的品種退化問題，對于擴大新疆特有珍稀藥用植物種植面積，提高天山雪蓮種植收入，滿足市場需求以及推廣常用中藥開發利用有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法。該方法利用切除根、葉后的天山雪蓮無菌苗的下胚軸莖段為外植體，通過含有不同濃度秋水仙素的固體培養基進行誘導處理，誘導產生四倍體天山雪蓮植株，通過改變染色體倍性使植株產生優良性狀以提高其生物量及藥用成分的含量，通過四倍體的篩選鑒定得到四倍體天山雪蓮。該方法提供了誘導四倍體產生的有效秋水仙素濃度、處理時間、處理溫度以及用于四倍體鑒定的形態學、染色體計數和流式細胞儀的改進方法。通過此方法可快速實現同源四倍體天山雪蓮植株的培育，進而有效提高其活性成分的含量，克服天山雪蓮在自然繁殖和人工種植中出現的品種退化問題。

發明所述的一種同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法，按下列步驟進行：

a、將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒20-50sec，然后用15％H₂O₂溶液消毒15-50min，將消毒后的種子用無菌水漂洗2-5次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種10-30粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；