技術領域

本發明涉及醫藥生物技術領域，尤其涉及破傷風外毒素C片段的B表位肽的應用。

背景技術

破傷風外毒素(tetanus?toxin，TT)是破傷風梭菌感染傷口后，在缺氧的條件下分泌產生的一種神經毒素，可導致患者因喉痙攣或繼發嚴重的肺部感染而死亡，死亡率可高達20％～50％。全世界每年約有5萬人死于破傷風，我國的破傷風死亡率高于世界平均水平。抗生素不能清除破傷風外毒素的毒性作用，具有中和毒素作用的抗破傷風毒素的抗體和疫苗是首選治療藥物。

破傷風外毒素蛋白分子量為150kDa。毒素經菌體釋放后，在蛋白水解酶的作用下，被“裂解”成一條輕鏈(50kDa)和一條重鏈(100kDa)，但輕鏈和重鏈之間仍有二硫鍵相連。輕鏈是鋅依賴蛋白酶，通過水解突觸囊泡蛋白-2來阻斷神經抑制性介質的釋放。C蛋白是重鏈的一部分，分子質量為50kDa，不具備神經毒素的活性，卻保留了完整毒素與神經節苷脂結合等許多性質，是毒素的保護性抗原。C蛋白還能將小分子蛋白靶向傳遞到運動神經元，所以也可作為蛋白載體促進低免疫原性抗原的免疫反應。由于C蛋白是破傷風毒素的非毒性片段，且有較高的免疫原性，因此是制備破傷風疫苗和篩選抗破傷風中和性單克隆抗體的一個理想靶標。

鑒于以上研究背景本發明預測并合成了破傷風外毒素C片段的B細胞表位，并對預測的B細胞表位的免疫原性和免疫保護性進行了鑒定，本發明的B細胞表位肽可用于破傷風梭菌感染的肽疫苗研究和利用B細胞表位肽制備特異的單克隆抗體診斷、預防和治療破傷風梭菌的感染。

發明內容

本發明的目的在于提供一種來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的應用，其中之一為：來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽在制備預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的藥物中的應用，其中所述破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1-4所示(其核苷酸序列分別如SEQ?IDNO：5-8所示)。

上述的來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽還可以用于制備抗破傷風毒素單克隆抗體。

本發明的另一目的是提供用于制備預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的藥物，其包含至少一個來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽，和藥學上可接受的載體，其中所述破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQID?NO：1-4所示。

所述藥學上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體中的至少一種。

本發明還提供一種預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的疫苗，其包含至少一個來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽，其中所述破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1-4所示。

本發明的思路如下：首先基于破傷風外毒素與配體相互作用的晶體結構，按B細胞表位的預測原則，對破傷風外毒素C片段的氨基酸序列進行分析，預測毒素片段的B細胞表位，并采用DNAStar軟件分析評價，人工合成B表位肽，用合成的B細胞表位肽偶聯載體蛋白鑰孔戚血藍素(keyhole?limpet?hemocyanin，KLH)后免疫Balb/c小鼠，檢測抗體效價鑒定其免疫原性；Western?blot鑒定鼠抗血清的特異性，并以天然破傷風外毒素攻毒，鑒定B細胞表位肽的免疫保護性，結果顯示：P4B細胞表位肽能刺激機體產生較強的抗破傷風外毒素的中和抗體，該肽段位于破傷風外毒素C片段N端第312～326位氨基酸。本發明的B表位肽可以用來研制人或小鼠用的破傷風肽疫苗，可以用來開發預防或治療破傷風梭菌感染的多肽藥物。

本發明經過深入而廣泛的研究，基于破傷風外毒素蛋白的晶體結構，輔以DNAStar軟件分析，選擇性的合成了4條可能誘導機體產生體液免疫應答的B細胞表位肽，并對其免疫特性進行評價，發現此4條表位肽能夠在Balb/c小鼠體內誘導特異性的體液免疫應答，產生的抗血清均能與破傷風外毒素蛋白發生特異性結合。因此，此四條多肽可以用于破傷風梭菌的多表位肽疫苗的設計；本發明的4條多肽可以用于人及動物用的疫苗及抗體藥物的開發。

為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。

附圖說明

圖1表示免疫印跡鑒定鼠抗血清的特異性，其中：

1表示P1B表位肽鼠抗血清的免疫印跡

2表示P2B表位肽鼠抗血清的免疫印跡

3表示P3B表位肽鼠抗血清的免疫印跡

4表示P4B表位肽鼠抗血清的免疫印跡。

具體實施方式