[技術領域]

本發明涉及干細胞獲取方法及其干細胞庫構建的方法，尤其涉及一種人脂肪成體干細胞的獲取方法及該干細胞庫的構建方法。

[背景技術]

干細胞研究是近年來醫學和生物學領域中最引人注目的熱點之一。干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。它包括胚胎干細胞和成體干細胞。近幾年研究表明，成體干細胞的分化能力遠超過傳統觀點所局限的范圍。因此目前干細胞的應用已經不再局限于利用胚胎干細胞的全能性去研究組織細胞再生，也不再局限只用組織本身的起始干細胞做細胞治療研究，而是趨于尋找更多的干細胞來源，通過研究他們的分化潛能，擴增能力，分化后的細胞功能以及取材是否安全方便等問題，選擇最合適的干細胞源來進行組織細胞再生修復。

最近研究證明，在來源于成體脂肪組織中的有核細胞中，像骨髓一樣也含有一種多能干細胞，國際上把這種細胞命名為脂肪來源干細胞(英文全稱：Adipose?Derived?Stem?Cells，簡稱ADSCs)。這種細胞群易分離，并像骨髓中的間充質干細胞那樣在特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、脂肪細胞、神經細胞等。許多研究表明，已有從人或其他物種上分離出來ADSCs，并且ADSCs的表面抗原與骨髓間充質干細胞基本類似。直接比較人的ADSCs和間充質干細胞的表面抗原，約多于90％都是一致的。實驗表明，ADSCs像骨髓源性的間充質干細胞一樣，經體外擴增后，其具有較低的免疫原性和免疫調節功能。這就表明ADSCs不會在體內引起T細胞(即胸腺依賴淋巴細胞)的細胞毒性反應。移植同種異基因ADSCs將不會引起強烈的免疫反應和后期的排斥反應，為ADSCs的同源異體移植提供了有利條件。此外，ADSCs來源廣泛，可以通過脂肪抽吸術或脂肪切除術從任何人體內獲得，安全無痛苦，且在體外培養穩定，擴增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成為目前研究的新熱點，不論在再生醫學還是基因治療方面都具有重大的應用潛力。

為了便于人們有效儲存和使用干細胞資源，目前在世界范圍內，已經建立了多個干細胞庫。所謂干細胞庫是在約為-196℃液氮中(深低溫)儲存干細胞及搜集存儲干細胞資源相關資料的場所。按所儲存的干細胞來源和采集方式，干細胞庫主要可分為胚胎干細胞庫、成體干細胞庫以及病理細胞庫，成體庫中包括臍血干細胞庫、骨髓和外周血干細胞庫、以及臍帶間充質干細胞庫。一個完善的干細胞庫應具備隨時隨地將儲存的健康干細胞提供臨床使用的能力。目前尚無脂肪成體干細胞庫，因此，構建脂肪成體干細胞庫，將人健康時的脂肪干細胞通過本發明建立的系統工程技術儲存建庫，是將現有資源充分利用的有效方法，為存儲本人、家屬和他人在需要采用脂肪成體干細胞移植及相關技術治療的各種疾病時，提供臨床適用型脂肪成體干細胞，其應用前景十分廣闊。

[發明內容]

本發明的目的在于克服以上技術的不足，而提供一種人脂肪成體干細胞的獲取方法，其具有成本低、應用前景廣闊，可為臨床和研究提供大量干細胞資源的特點。

本發明的另一目的在于克服以上技術的不足，而提供一種人脂肪成體干細胞庫的構建方法，其具有成本低、應用前景廣闊，可為臨床和研究提供大量干細胞資源的特點。

本發明提供的一種人脂肪成體干細胞的獲取方法，包括：

(1)采集脂肪：對供者進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型的檢測、微生物免疫檢測，體檢HIV、HBV、HCV，然后在無菌場所采集供者的脂肪；

(2)獲取和分離人脂肪成體干細胞：取20mL脂肪組織，剔除脂肪中肉眼可見的血管和纖維部分，用pH值為7.2-7.4的D-Hank’s平衡鹽液反復沖洗，去除殘留的血液，將脂肪組織絞碎為1-2mm³小塊，加入與所取脂肪組織等體積的0.2％膠原酶磷酸緩沖液消化，在37℃溫度條件下均勻震蕩消化50-70分鐘，再置于離心機中以1600-2000轉/分鐘的轉速離心4-10分鐘，去除表層脂肪；將底層細胞用pH值為7.2-7.4的D-Hank’s平衡鹽液反復吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，將濾液以900轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得干細胞；