技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于對人和動(dòng)物EV71中和抗體(即針對EV71的中和性抗體)進(jìn)行競爭酶聯(lián)免疫定性、定量的檢測方法和試劑盒或試劑，具體可涉及用于對血清(漿)中EV71中和抗體進(jìn)行檢測的的檢測方法和試劑盒或試劑，其中尤其涉及EV71中和抗體的競爭酶聯(lián)免疫檢測方法。?

背景技術(shù)

EV71病毒(enterovirus)顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突出，極其渺小，直徑約24～30nm，其基因組為單股正鏈RNA。EV71病毒在病毒學(xué)上的分類是屬于微小RNA病毒科中的腸病毒屬，分為A、B、C三種基因型。EV71病毒主要經(jīng)糞口途徑傳播，易感人群為5歲以下的嬰幼兒，主要引起手足口疾病，此外還可引發(fā)心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，導(dǎo)致兒童死亡，感染性強(qiáng)且致殘致死率高。?

EV71病毒于1969年首次被分離，隨后世界許多國家都有EV71流行的報(bào)道。近幾年來，EV71在亞太地區(qū)的流行呈逐年上升的趨勢。國內(nèi)1981年上海首次報(bào)道本病；此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海和廣東等10幾個(gè)省市均有報(bào)道。1983年天津發(fā)生CoxA16引起的手足口病暴發(fā)，其中5-10月間發(fā)生了7000余病例。其后，經(jīng)過2年低水平散發(fā)后，1986年再次暴發(fā)。?

2007年山東臨沂、青島和濟(jì)南等地發(fā)生主要由EV71引起的手足口病的流行，其中報(bào)告病例近4萬例，報(bào)告死亡病例14例。2008年到2009年期間，國內(nèi)的手足口病形勢更加嚴(yán)峻。但是目前由?EV71帶來的手足口病尚無有效的藥物治療方式，也無相關(guān)疫苗問世，所以預(yù)防控制難度大。同時(shí)，該病具有隱性感染和輕癥病例多、傳染源難以發(fā)現(xiàn)和控制、兒童普遍易感、傳播途徑多、難以有效阻斷等特點(diǎn)，在我國已納入丙類傳染病管理。?

國內(nèi)外學(xué)者正致力于EV71疫苗的研究。疫苗的免疫保護(hù)性主要在于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，然后中和抗體與病毒結(jié)構(gòu)蛋白上的中和抗原表位結(jié)合，阻斷該表位與敏感細(xì)胞細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，以阻止病毒感染細(xì)胞發(fā)揮疫苗的保護(hù)作用。中和抗體活性是疫苗免疫效果的重要依據(jù)與指標(biāo)。目前EV71研究缺少有效的動(dòng)物模型，對EV71敏感的動(dòng)物只有剛出生3-5天的乳鼠，而使用該動(dòng)物無法進(jìn)行免疫后攻毒保護(hù)性研究，否則動(dòng)物就達(dá)到安全年齡段從而對該病毒不再敏感。另外，在利用WHO認(rèn)定的體外中和試驗(yàn)參考方法(檢測體外中和抗體滴度)評價(jià)疫苗的有效性時(shí)，其體內(nèi)免疫攻毒實(shí)驗(yàn)和體外中和試驗(yàn)不僅耗時(shí)，還需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，方法繁瑣，價(jià)格昂貴，試驗(yàn)周期長，需要有較好的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及技術(shù)人員。因此開發(fā)一種簡便、安全、快捷的EV71中和抗體的檢測方法，具有重要的實(shí)用價(jià)值。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種EV71病毒A、B、C三基因型廣譜中和抗體競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，能夠快速有效的檢測人和其他動(dòng)物樣本中的EV71中和抗體，代替EV71病毒動(dòng)物體內(nèi)攻毒試驗(yàn)與抗血清體外中和試驗(yàn)，克服體內(nèi)攻毒試驗(yàn)無法進(jìn)行的缺點(diǎn)，用于評價(jià)疫苗的有效性以及對待測受試者樣本中針對EV71的抗體進(jìn)行定性、定量檢測。?

具體的，本發(fā)明一方面提供了一種檢測EV71的中和抗體(本文中也將其稱為“EV71抗體”或“EV71中和抗體”)的含量的試劑盒或試劑，其包含保藏號為CGMCC?No.2937的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段。?

另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的試劑盒或試劑在定性或定量檢測EV71中和抗體中的用途。?

再一方面，本發(fā)明提供了一種定性或定量檢測EV71中和抗體的方法，其中包括使用本發(fā)明所述的試劑盒或試劑。?

還一方面，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明所述的試劑盒或試劑的方法，其中使用保藏號為CGMCC?No.2937的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段。?

另外，本發(fā)明還提供了一種評價(jià)針對EV71疫苗的有效性的方法，其包括使用本發(fā)明的試劑盒或試劑或使用保藏號為CGMCC?No.2937的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段。?

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段是生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的(例如酶標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的)，進(jìn)一步優(yōu)選地，其中所述的標(biāo)記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標(biāo)記或是熒光素標(biāo)記、生物素、膠體金離子、堿性磷酸酶標(biāo)記的。?