1.哲羅鮭微衛星序列的獲取方法，其特征在于哲羅鮭微衛星序列按以下 步驟獲得：一、提取哲羅鮭基因組DNA；二、哲羅鮭基因組DNA的酶切和微 衛星富集文庫的構建；三、菌落PCR擴增并進行陽性克隆檢測和測序，即獲 得哲羅鮭微衛星序列；步驟二中采用限制性內切酶單酶切或雙酶切哲羅鮭基因 組DNA；

其中，步驟二分以下步驟實現：

a、哲羅鮭基因組DNA的酶切：

哲羅鮭基因組DNA酶切體系為20μL，由2μL?10×酶切buffer、0.2μL濃 度為10ng/μL的BSA、2.5U限制性內切酶、5μL濃度為100ng/μL的哲羅鮭基 因組DNA和余量的滅菌去離子水組成；酶切孵育時間為4h；

b、連接：

連接體系為40μL，由20μL步驟a酶切片段、2μL粘末端雙鏈接頭、4μL 10×buffer、6weiss單位T4?DNA連接酶和余量的滅菌去離子水組成，并于4℃ 水浴中過夜連接；其中雙鏈接頭按以下步驟制備：等體積混合濃度均為 10pmol/L的單鏈寡核苷酸連接頭A和單鏈寡核苷酸連接頭B，95℃變性10min， 然后經過4h勻速冷卻至10℃，即得到雙鏈接頭；

c、目的片段獲取：

用單鏈寡核苷酸連接頭A做擴增引物進行擴增，擴增反應體系為25μL， 由3μL步驟b連接產物、1.5μL引物、2.5μL?10×Buffer、1.5μL濃度為25mmol/L 的MgCl₂、2μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、0.3μL濃度為5U/μL的Taq酶和 余量的無菌超純水組成；擴增反應程序為：72℃2min，94℃預變性5min，循 環設置為94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，共14～20個循環，72℃ 延伸10min；擴增產物用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Promega?PCR 產物回收試劑盒切膠回收長度為500～900bp的DNA片段；

d、微衛星富集文庫的構建：

I、雜交

取12μL步驟c回收的DNA片段置于95℃環境中變性10min，然后立即 加入到68℃、體積為38μL的雜交液中雜交1h后得到雜交DNA；其中38μL 的雜交液由1.5μL濃度為10μmol/L的生物素標記的含有重復序列的探針、5μL 濃度為10pmol/L的單鏈寡核苷酸連接頭A，15μL?20×SSC，0.5μL質量濃度為 10％的SDS和16μL?ddH₂O組成；

II、平衡磁珠

在1.0mL離心管中加入100μL鏈霉親和素磁珠和200μL洗液C洗滌2次， 然后將離心管放在磁力架上使磁珠吸附在管壁上，棄除上清液，再用200μL 洗液D洗滌磁珠3～5次，之后加入150μL洗液D室溫放置，即得到平衡磁珠； 洗液C中pH值為8.0時EDTA?的濃度為1mmol/L、pH值為8.0的Tris-Cl的 濃度為10mmol/L、NaCl的濃度為2mmol/L；洗液D是用6×SSC液稀釋的質 量濃度為0.1％的SDS溶液；

III、親和捕捉

將步驟I得到的雜交DNA加入步驟II平衡磁珠中25℃溫浴20min，然后 去除上清液，再用洗液D25℃洗滌磁珠2次，每次10min，之后用洗液E?68℃ 洗滌磁珠2次，再用洗液F洗滌磁珠2次，而后用200μL?0.1×TE洗滌磁珠2 次，再加入30μL?0.1×TE在95℃變性10min，然后收集上清液，即得到含有重 復序列的單鏈DNA片段；其中洗液E是用3×SSC液稀釋的質量濃度為0.1％ 的SDS溶液，洗液F為6×SSC液；

IV、PCR擴增含有微衛星序列的DNA片段

PCR反應體系為25μL，由內含4種dNTP的混合PCR緩沖液18μL、單 鏈寡核苷酸連接頭A為引物0.5μL、Taq?DNA聚合酶0.5μL，步驟III收集的上 清液4μL和余量的無菌水組成；PCR擴增反應程序為：94℃預變性5min，循 環設置為94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸1min，共20～30個循環，72℃ 延伸10min，用Promega?PCR產物回收試劑盒純化回收，去除多余的引物、dNTP 和接頭；

V、T-載體連接及克隆

T-載體連接反應體系為10μL，由5μL?T-載體商業包裝中2×連接緩沖液、 1μL載體pMD18-T?vector和4μL步驟IV純化回收的DNA片段組成；同時以T 載體自身連接作為對照，4℃連接過夜；再用CaCl₂制備的感受態大腸桿菌 DH5α進行轉化，得到基因組微衛星富集文庫，并將文庫中的單菌落轉移培養 平板中按順序排列；

步驟二d?I中生物素標記的含有重復序列的探針為生物素標記的(CA)₁₆寡 核苷酸探針或生物素標記的(CAG)₁₆寡核苷酸探針；

步驟二a中限制性內切酶為限制性內切酶Tsp509I、限制性內切酶Tru9I、 限制性內切酶CviQI、限制性內切酶BfaI、限制性內切酶Sau3AI或限制性內 切酶TaqI；步驟二中使用限制性內切酶Tsp509I其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿 基序列為5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列 為5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′；使用限制性內切酶Tru9I、CviQI或BfaI 其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，單鏈 寡核苷酸連接頭B的堿基序列為5′-TACTCAGGACTCAT-3′；使用限制性內切 酶Sau3AI其單鏈寡核苷酸連接頭A的堿基序列為 5′-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3′，單鏈寡核苷酸連接頭B的堿基序列 為5′-CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG-3′；使用限制性內切酶TaqI其單鏈寡 核苷酸連接頭A的堿基序列為5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，單鏈寡核苷酸 連接頭B的堿基序列為5′-CGCTCAGGACTCAT-3′；

步驟三中用通用引物M13+或M13-與含有重復序列的探針為引物進行菌 落PCR擴增，PCR反應體系為15μL，由0.6μL濃度為10μmol/L的正向引物、 0.6μL濃度為10μmol/L的反向引物、1.5μL?Taq?DNA聚合酶商業包裝中 10×Buffer、0.9μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、1.2μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、 0.12μL濃度為5U/μL的Taq?DNA聚合酶和余量的無菌去離子水組成；用無菌 牙簽按順序將單菌落挑入反應管中進行菌落PCR，PCR反應程序為94℃預變 性5min，94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，共30個循環，72℃ 延伸5min，PCR反應產物用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑取PCR擴 增產物為200～750bp的具有明顯條帶的陽性克隆進行測序；

步驟二d?I中選用生物素標記的(CA)₁₆寡核苷酸探針，則步驟三PCR擴增 引物為M13+和(CA)₁₀，或者M13-和(CA)₁₀；步驟二d?I中選用生物素標記的 (CAG)₁₆寡核苷酸探針則步驟三PCR擴增引物為M13+和(CAG)₆，或者M13- 和(CAG)₆。