技術領域

本發明涉及一種提高體細胞胚發育同步化的方法。

背景技術

水曲柳(Fraxinus?mandshurica?Rupr.)屬木犀科白蠟樹屬，是我國東北重要的珍貴硬闊樹種之一。其樹干通直，樹齡長，木材材質優良，紋理美觀，廣泛應用于軍工、建筑、機械、航空、車輛、居室裝修、運動器械制造等方面。水曲柳種子具有深休眠特性，利用傳統的種子繁殖苗木存在種子處理時間長、幼苗成型慢，繁殖周期長等問題，很難在短時間內得到大量的、具有特定優良性狀的水曲柳優質苗木。植物組織培養技術中的體細胞胚胎發育技術以其繁殖數量大、繁殖速度快、后代遺傳性狀穩定等優點受到人們的青睞，水曲柳體細胞胚胎發育技術為解決水曲柳種子匱乏和水曲柳優良品系種質保存的問題提供了一個重要的方法和手段。

目前，水曲柳體細胞胚胎發育技術中存在嚴重的體細胞胚胎發育不同步化，即體細胞胚發育階段不一致、體細胞胚大小差異很大，體細胞胚發育的一致性差(小于7％)，導致體細胞胚再生植株的存活率低(小于12％)；而且存在利用化學調控，導致體細胞胚后期發育不正常、體細胞胚畸形(高達75％)的問題，無法實現水曲柳體細胞胚的工廠化和自動化生產，不能滿足大面積造林的需要。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有水曲柳體細胞胚胎發育技術中存在體細胞胚胎發育不同步化，體細胞胚發育的一致性差，導致體細胞胚再生植株的存活率低以及利用化學調控，導致體細胞胚畸形率高的問題，而提供的一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法。

提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法按以下步驟實現：一、將水曲柳外植體接種于體細胞胚誘導培養基中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％的無光照條件下培養至得到球形體細胞胚；二、將球形體細胞胚接種于同步化調控培養基中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％、每20～30天更換新鮮同步化調控培養基的無光照條件下培養40～60天，得成熟體細胞胚；三、將成熟體細胞胚從外植體上剝離出來后置于無菌的空培養皿中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％的自然光照條件下干燥10～30min，然后接種于萌發培養基中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％、每天光照14～18h、光照強度為1500～2000Lux、每20～30天更換新鮮萌發培養基的條件下培養60～80天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳體細胞胚發育同步化；其中步驟一中體細胞胚誘導培養基是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L體細胞胚誘導培養基中還包含400～700mg的酸水解酪蛋白、40000～70000mg的蔗糖、1.0～1.5mg的奈乙酸、0.1～0.5mg的6-芐基氨基嘌呤和6000～7000mg的瓊脂，pH值為5.8；步驟二中同步化調控培養基是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L同步化調控培養基中還包含20000～50000mg的蔗糖和6000～7000mg的瓊脂，pH值為5.8；步驟三中萌發培養基是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L萌發培養基中還包含20000～25000mg的蔗糖、100～200mg的酸水解酪蛋白、0.01～0.05mg的奈乙酸和6000～7000mg的瓊脂，pH值為5.8。

本發明成本低、操作簡單，通過調節同步化調控培養基中的蔗糖濃度，可調節培養基的滲透壓，進而實現對水曲柳體細胞胚同步化發育的物理調控，避免了化學調控可能帶來的體細胞胚后期發育不正常、體細胞胚畸形的問題，使體細胞胚畸形率降低到50％以下，體細胞胚發育的一致性達80％以上；本發明采用的干燥可提高水曲柳體細胞胚再生植株的存活率，存活率高達64％～81％，并且干燥后的體細胞胚萌發后其植株抗性明顯增強，移栽到土壤介質中，則90％以上均可成活，且后期生長幾乎不受影響。

具體實施方式