技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程研究領(lǐng)域，具體涉及一種食蟹猴(Cynomolgus?Monkey，Macacafascicularis)的P450?2C9藥物代謝酶(Cytochrome?P450?2C9)及其與P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450?oxidoreductae)的共表達(dá)重組載體。

背景技術(shù)

細(xì)胞色素P450是重要的藥物代謝I相酶，市場(chǎng)上80％以上的藥物是通過(guò)細(xì)胞色素P450代謝的。2C亞家族是細(xì)胞色素P450基因家庭的主要成員，主要包括2C8、2C9及2C18幾個(gè)成員。細(xì)胞色素P450?2C9能夠代謝多種藥物如雙氯芬酸(Diclofenac)、甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、華法林((s)-(-)-warfarin)等。目前，包括人，狗，大鼠，小鼠等多種動(dòng)物的細(xì)胞色素P450基因序列已經(jīng)被克隆，各種細(xì)胞色素P450也已經(jīng)在大腸桿菌，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等宿主中表達(dá)。異源表達(dá)的細(xì)胞色素P450是研究藥物代謝，進(jìn)行體外藥物篩選的重要手段。食蟹猴是常用的臨床前安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)大動(dòng)物，其與人的親緣關(guān)系非常接近，因而在代謝上表現(xiàn)出較高的相似性。到目前為止，仍未見食蟹猴與人P450?2C9亞型相應(yīng)的基因的克隆的報(bào)道。因此，克隆食蟹猴P450?2C9基因并進(jìn)行異源表達(dá)對(duì)于體外藥物篩選有重要意義。

P450酶在催化反應(yīng)中需要兩個(gè)電子和兩個(gè)質(zhì)子，其中的電子由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽，還原型輔酶II)-細(xì)胞色素P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450oxidoreductae)提供。在體外反應(yīng)中，缺少NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的系統(tǒng)不具有催化活性。到目前為止，將食蟹猴P450?2C9與食蟹猴P450氧化還原酶基因共表達(dá)還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種食蟹猴的P450?2C9藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達(dá)重組載體。克隆食蟹猴P450?2C9基因(cyp?2C9)并在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)；還包括克隆食蟹猴NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因，構(gòu)建包含NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的食蟹猴P450?2C9(cyp?2C9)的昆蟲表達(dá)載體，并將此載體用于大量制備食蟹猴P450?2C9的代謝物。

本發(fā)明通過(guò)以下方式達(dá)到該目的：

本發(fā)明的食蟹猴(Cynomolgus?Monkey，Macaca?fascicularis)的P450?2C9藥物代謝酶(Cytochrome?P450?2C9)，能催化雙氯芬酸(Diclofenac)的4’-羥基化(4’-hydroxy)、甲苯磺丁脲(Tolbutamide)的4’-羥基化(4’-hydroxy)和華法林((s)-(-)-warfarin)的7’-羥基化(7’-hydroxy)。

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人P450基因序列(Genebank，Accession?NO.：NM_000771)，以逆轉(zhuǎn)錄自食蟹猴肝RNA的cDNA為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增食蟹猴P450?2C9的編碼區(qū)序列(cyp2C9)，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與pMD?18-T載體連接得到pT-cynoP2C9質(zhì)粒。其中，設(shè)計(jì)的引物不包含除起始密碼(ATG)外的食蟹猴P450?2C9的編碼區(qū)序列(cyp?2C9)。經(jīng)測(cè)序，得到的編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1473堿基對(duì)，編碼491個(gè)氨基酸。即P450?2C9藥物代謝酶的基因序列或其互補(bǔ)序列是與SEQID?NO：1的突變率為0-1％的序列。

本發(fā)明的食蟹猴的P450?2C9藥物代謝酶與P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450oxidoreductae)共表達(dá)的重組載體包含上述食蟹猴的P450?2C9藥物代謝酶序列的開放閱讀框和食蟹猴P450氧化還原酶序列的開放閱讀框。以上述克隆的食蟹猴P450?2C9的基因(cyp?2C9)為模板，以包含RsrII及HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物擴(kuò)增食蟹猴P450?2C9的編碼區(qū)序列(cyp?2C9)并定向插入昆蟲表達(dá)載體pFastBac-Dual的RsrII及HindIII酶切位點(diǎn)之間，得到pFB-cynoP2C9表達(dá)載體。按照Bac-to-Bac中表達(dá)食蟹猴P450?2C9蛋白。異源表達(dá)的食蟹猴P450?2C9蛋白可以用作體外篩選，測(cè)試藥物的代謝性質(zhì)。