技術領域

本發明涉及基因工程研究領域，具體涉及一種食蟹猴(Cynomolgus?Monkey，Macacafascicularis)的P450?2E1藥物代謝酶(Cytochrome?P450?2E1)及與P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450?oxidoreductae)共表達的重組載體。

背景技術

細胞色素P450是重要的藥物代謝I相酶，市場上80％以上的藥物是通過細胞色素P450代謝的。2E亞家族是細胞色素P450基因家庭的主要成員，主要包括2E1。細胞色素P450?2E1能夠代謝多種藥物如氯唑沙宗(Chlorzoxazone)等。包括人，狗，大鼠，小鼠等多種動物的細胞色素P450基因序列已經被克隆，各種細胞色素P450也已經在大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞等宿主中表達。異源表達的細胞色素P450是研究藥物代謝，進行體外藥物篩選的重要手段。食蟹猴是常用的臨床前安全性評價實驗大動物，其與人的親緣關系非常接近，因而在代謝上表現出較高的相似性。到目前為止，仍未見食蟹猴與人P450?2E1亞型相應的基因的克隆的報道。因此，克隆食蟹猴P450?2E1基因并進行異源表達對于體外藥物篩選有重要意義。

P450酶在催化反應中需要兩個電子和兩個質子，其中的電子由內質網上的NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽，還原型輔酶II)-細胞色素P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450oxidoreductae)提供。在體外反應中，缺少NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的系統不具有催化活性。到目前為止，將食蟹猴P450?2E1與食蟹猴P450氧化還原酶基因共表達還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種食蟹猴的P450?2E1藥物代謝酶及與P450氧化還原酶共表達的重組載體。克隆食蟹猴P450?2E1基因(cyp?2E1)并在昆蟲細胞中進行異源表達；還包括克隆食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因，構建包含NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的食蟹猴P4502E1(cyp?2E1)的昆蟲表達載體，并將此載體用于大量制備食蟹猴P450?2E1的代謝物。

本發明通過以下方式達到該目的：

本發明的食蟹猴(Cynomolgus?Monkey，Macaca?fascicularis)的P450?2B6藥物代謝酶(Cytochrome?P450?2E1)，能催化氯唑沙宗(chlorzoxazone)的6’-羥基化(6’-Hydroxy)。

根據已經發表的人P450基因序列(Genebank，Accession?NO.：NM_000773)，以逆轉錄自食蟹猴肝RNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增食蟹猴P450?2E1的編碼區序列(cyp2E1)，擴增得到的PCR產物與pMD?18-T載體連接得到pT-cynoP2E1質粒。其中，設計的引物不包含除起始密碼(ATG)外的食蟹猴P450?2E1的編碼區序列(cyp?2E1)。經測序，得到的編碼區序列全長1482堿基對，編碼494個氨基酸，即P450?2B6藥物代謝酶的基因序列或其互補序列是與SEQID?NO：1的突變率為0-1％的序列。

本發明的食蟹猴的P450?2E1藥物代謝酶與P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450oxidoreductae)的共表達重組載體包含上述食蟹猴的P450?2E1藥物代謝酶序列的開放閱讀框和食蟹猴P450氧化還原酶序列的開放閱讀框。以上述克隆的食蟹猴P450?2E1的基因(cyp2E1)為模板，以包含RsrII及HindIII限制性內切酶位點的引物擴增食蟹猴P450?2E1的編碼區序列(cyp?2E1)并定向插入昆蟲表達載體pFastBac-Dual的RsrII及HindIII酶切位點之間，得到pFB-cynoP2E1表達載體。按照Bac-to-Bac中表達食蟹猴P450?2E1蛋白。異源表達的食蟹猴P450?2E1蛋白可以用作體外篩選，測試藥物的代謝性質。