技術領域

本發明涉及一種酶的制備方法及其藥物組合物，具體涉及一種天然精氨酸酯酶的制備方法及其藥物組合物。屬于生物醫藥技術領域。

背景技術

蛇毒類凝血酶是蛇毒中與血漿凝血酶性質相似的一類酶的總稱，通常具有精氨酸酯酶活性，又稱為精氨酸酯酶。它可酶解血液中纖蛋白原，但不激活體內各種凝血因子。因此可在體外使血漿或血纖蛋白溶液凝固，而在體內生成的血纖蛋白凝塊結構松散，易被纖溶系統清除，使纖蛋白原濃度顯著下降，表現出抗凝作用。這種特性使精氨酸酯酶成為開發溶栓抗凝藥物的重要來源，但精氨酸酯酶分子基因內部存在多種非同義核苷酸突變，使精氨酸酯酶的同功酶在功能上存在差異。蝮蛇蛇毒中含4種以上精氨酸酯酶同功酶，酶的分子量、糖基化程度、體內半衰期、底物專一性、比活性都有區別。因此在用作臨床治療藥物時需要分開，進行結構確認，測定氨基酸組成、N-末端氨基酸序列，并精確測定相對分子量等資料。分離不完全會造成精氨酸酯酶終產品中含多種其它蛇毒蛋白，在臨床應用可能出現副反應；同時蛋白結構和性質未得到充分鑒定的產品在生產中難于控制產品質量，不能保障藥品使用的安全性，危害病人生命健康。因此，需要發展蛇毒精氨酸酯酶制備新技術，并對制備的精氨酸酯酶進行充分的結構和性質鑒定，才能保障用作藥物時的安全性。

經對現有技術的文獻檢索發現，翟寧等在《中國醫藥工業雜志》(2005年36卷601-603頁)發表了題為“尖吻蝮蛇毒中一種新類凝血酶的分離純化”的論文，提出如下技術方案：首先用陰離子交換色譜初步純化，其次用高效凝膠過濾色譜進行精制，最后用高效凝膠過濾色譜分析制備的類凝血酶純度。由于該方法使用凝膠過濾色譜作為制備手段之一，因此存在著上樣量低、產量低、生產效率難于提高的缺點。同時，由于該研究未對制備的類凝血酶進行充分的蛋白結構和性質鑒定，難于用作治療性藥物。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種天然精氨酸酯酶的制備方法及其藥物組合物，使其能夠快速、簡便制備天然精氨酸酯酶，以及制備含該天然精氨酸酯酶的藥物組合物，用于治療和預防多種血栓和栓塞性疾病。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明首先制備天然精氨酸酯酶，并對其進行結構確認，然后將其用于制備含該天然精氨酸酯酶的藥物組合物。

本發明天然精氨酸酯酶的制備方法具體包括如下步驟：

(1)用裝有三氮嗪固定的L-精氨酸分離材料的親和層析柱在pH?6.0的緩沖液條件下吸附粗蛇毒原料中的天然精氨酸酯酶，再用pH?10.3的緩沖液洗脫，收集洗脫組分得到天然精氨酸酯酶粗品；

(2)然后用弱陰離子離子交換層析對上述天然精氨酸酯酶粗品進行精制，在pH?7.0緩沖液條件下上樣，用NaCl?0-0.3M的濃度梯度洗脫進行精制，得到天然精氨酸酯酶精制品，反相高效液相色譜和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明制備的天然精氨酸酯酶精制品純度高于98％。

采用初凝法測上述天然精氨酸酯酶精制品的活性，結果表明該天然精氨酸酯酶的比活性大于每毫克蛋白10000降纖酶活力單位，用Edman降解法測定該天然精氨酸酯酶的N端氨基酸序列，為Val?Ile?Gly?Gly?Val?Glu?Cys?Asp?Ile?AsnGlu?His?Arg?Phe?Leu，用基質輔助激光解離質譜方法測定該天然精氨酸酯酶完整分子的質量為34.07±0.20kDa，用TFMS(三氟甲磺酸)脫去所含糖鏈再用基質輔助激光解離質譜方法測定分子的質量為28.01±0.20kDa。所述天然精氨酸酯酶的這些結構數據有助于制定科學的原料藥質量標準，在生產中更嚴格的控制藥品質量，提高臨床使用的安全性。

本發明藥物組合物，含有安全和治療有效量的上述天然精氨酸酯酶0.000083-0.129％以及藥學上可接受的藥物載體或輔料99.871-99.999917％。所述藥物載體或輔料包括填充劑、粘合劑、崩解劑或溶脹性輔料、潤滑劑、助流劑、抗粘著劑，吸收促進劑。

在控制生產環境的溫度、濕度、水分的條件下，將上述天然精氨酸酯酶與各種類型的藥物載體或輔料均勻混合，每劑量包括上述天然精氨酸酯酶(以蛋白質量計算為0.01-10μg)、填充劑0-200mg、粘合劑0-200mg、崩解劑或溶脹性輔料0-300mg、潤滑劑0-20mg、助流劑0-15mg、抗粘著劑0-15mg、吸收促進劑0-300mg等，制備成相應的制劑形式。

所述的填充劑選自淀粉、糊精、環糊精、糖粉、乳糖、甘露醇、磷酸氫鈣或微晶纖維素、纖維素，也可以是它們的混合物。