技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及了一種檢測(cè)血清EB病毒gp78抗體的ELISA試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

EB病毒(Epstein-Barr?virus，EBV)屬于γ皰疹病毒科，其基本結(jié)構(gòu)包括核樣物、衣殼和囊膜三部分。衣殼為20面體立體對(duì)稱，由162個(gè)殼微粒組成。囊膜由感染細(xì)胞的核膜組成，其上有病毒編碼的膜糖蛋白，有識(shí)別淋巴細(xì)胞上的EB病毒受體，及與細(xì)胞融合等功能。此外在囊膜與衣殼之間還有一層蛋白被膜。EB病毒僅能在B淋巴細(xì)胞中增殖，可使其轉(zhuǎn)化，能長(zhǎng)期傳代。被病毒感染的細(xì)胞具有EBV的基因組，并可產(chǎn)生各種抗原，已確定的有：EBV核抗原(EBNA)，早期抗原(EA)，膜抗原(MA)，衣殼抗原(VCA)，淋巴細(xì)胞識(shí)別膜抗原(LYDMA)。

EB病毒在人群中廣泛存在，其致病性具有明顯的區(qū)域特征。在我國(guó)南方主要與鼻咽癌密切相關(guān)，鼻咽癌患者的多種EB病毒抗體水平要明顯高于非患者。除LYDMA外，鼻咽癌患者EBNA、MA、VCA、EA均產(chǎn)生相應(yīng)的lgG和IgA抗體，研究這些抗原及其抗體，對(duì)闡明EBV與鼻咽癌關(guān)系及早期診斷均有重要意義。

免疫血清學(xué)檢測(cè)EB病毒感染是目前篩查鼻咽癌最常用的手段。目前間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)血清VCA/IgA、EA/IgA已在臨床被廣泛采用。IFA的優(yōu)點(diǎn)在于比較敏感特異，但是其結(jié)果的判斷帶有主觀性，不易標(biāo)準(zhǔn)化，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展創(chuàng)新，研究者正在努力以其它技術(shù)如免疫斑點(diǎn)、免疫印跡、ELISA等代替IFA，其中ELISA方法最受重視。ELISA簡(jiǎn)單、快速、敏感，并且易于自動(dòng)化，適于大規(guī)模篩選樣本。已報(bào)道用于ELISA的EBV抗原包括感染EBV細(xì)胞的提取物、重組的EBV蛋白以及合成的多肽。

本發(fā)明利用ELISA技術(shù)建立了檢測(cè)血清中抗EB病毒膜抗原gp78抗體的試劑盒，此試劑盒適用于鼻咽癌的早期診斷和大規(guī)模的病人篩查，并可用于監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)病人。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)抗EB病毒gp78抗體的ELISA試劑盒。??一種檢測(cè)抗EB病毒gp78抗體的ELISA試劑盒，主要包括有：包被有NeutrAvidin(親和素)的ELISA板，所述NeutrAvidin與生物素標(biāo)簽的EB病毒gp78抗原結(jié)合。

所述檢測(cè)抗EB病毒gp78抗體的ELISA試劑盒還包括有：包被緩沖液(35mM?NaHCO₃，15mM?Na₂CO₃，PH9.6)，樣品稀釋液(1×PBS，1％BSA，0.05％NaN₃，PH7.2±0.2)，洗脫液(1×PBS，0.05％吐溫-20)，HRP標(biāo)記的羊抗人IgA或IgG。

偶聯(lián)有生物素的EB病毒gp78抗原為人工合成的具有Biotin-Ahx-Thr?Ser?Thr?Ser?HisArg?Pro?His?Arg?Arg?Pro?Val?Ser?Lys?Arg?Pro?Thr?His?Lys(Biotin-Ahx-TSTSHRPHRRPVSKRPTHK)系列的多肽。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述試劑盒的制備方法。

一種制備上述檢測(cè)抗EB病毒gp78抗體的ELISA試劑盒的方法，包括以下步驟：

包被緩沖液將NeutrAvidin稀釋成3.5-4.5μg/ml，在ELISA板的每孔中加入50-100μl，4℃過(guò)夜；取出，置于37℃30min；甩去液體，PBS洗滌2-4次；控干，加入1×PBS稀釋的3-5％BSA(小牛血清白蛋白)封閉，100μl/孔，37℃，2hr；甩去液體，PBS洗滌2次；每孔加入1.8-2.2μg/ml帶有生物素標(biāo)簽的gp78抗原50-100μl，4℃過(guò)夜；甩去液體，洗滌緩沖液洗1-3次；放于4℃，備用。

使用時(shí)，血清樣本用樣品稀釋液以1∶100稀釋，以50-100μl/孔的體積加樣，37℃，60min；甩去液體，用洗滌緩沖液洗滌5次；控干，加入稀釋好的HRP標(biāo)記的羊抗人IgA或IgG，50-100μl/孔，37℃，60min；甩去液體，用洗滌緩沖液洗滌5次；加入底物，四甲基聯(lián)苯胺H₂O₂，50-100μl/孔，室溫避光孵育15-30min；加入2mol/L?H₂SO₄?25-50μl中止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀上(450nm)測(cè)定OD值。