技術領域

本發明屬于生物工程技術，具體的說是一種產腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其構建。

背景技術

基因敲除技術是自80年代末發展起來的一種分子生物學技術，它是一種通過一定的途徑使特定的基因定向失活或缺失的技術。隨著分子生物學的發展和后基因組時代的到來，這項技術得到了前所未有的發展。利用基因敲除技術，人們不但可以對特定的基因進行定向的改造，而且可以通過該技術來了解未知基因的結構及功能。正因為基因敲除技術的這些優越性，近年來這項技術在微生物基因工程菌的構建方面得到了廣泛的應用。

金黃色葡萄球菌溶血毒素是由金黃色葡萄球菌在生長過程中產生的一種外毒素，由α、β、γ、δ四種亞型溶血毒素組成。由于α-溶血毒素能對人和哺乳動物紅細胞產生較強的溶血性，因此在臨床上被認為是金黃色葡萄球菌致病的主要因素之一。用于醫藥工業上以金黃色葡萄球菌發酵生產含有效成份腸毒素的抗腫瘤藥物中含有α-溶血毒素，因此在臨床應用中對人體產生了較強的毒副作用，限制了其醫用價值。因此，尋找一種合適的技術方法來構建產腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺陷菌株，無疑對提高含腸毒素抗腫瘤藥物的醫藥價值具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種產腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其構建。本發明根據同源重組的原理，利用基因敲除技術構建相應的基因敲除載體，轉化產腸毒素金黃色葡萄球菌，經過篩選驗證最終得到了產腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株。通過該方法獲得的α-溶血毒素缺失型基因工程菌最終不產生α-溶血毒素，但不影響腸毒素的生產。

本發明的第二個目的是提供一種構建上述金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為；

一種產腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株，是通過同源重組的方法將產腸毒素的野生型菌株的α-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。

所述產腸毒素的野生型菌株為金黃色葡萄球菌，菌種保藏號為：CGMCC0165，現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

缺失菌株可按如下步驟制備：

1)利用PCR技術擴增得到α-溶血毒素基因上游同源序列Hla-u和下游同源序列Hla-d，以及替換基因Neor；并將Hla-u、Hla-d、Neor連接得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd；

2)將Hu-Neor-Hd片段克隆入載體pMAD，經PCR擴增和酶切驗證得到基因敲除載體pMHL-α，然后將pMHL-α載體轉化進金黃色葡萄球菌RN4220進行基因修飾；

3)將基因修飾過的基因敲除載體pMHL-α通過原生質體轉化導入產腸毒素野生型金黃色葡萄球菌CGMCC0165細胞內，通過培養，篩選得到產腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株。

一種產腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株的構建方法，可按如下步驟操作：

(1)根據Genbank已公開的金黃色葡萄球菌α-溶血毒素基因序列，設計兩對引物，分別為：Hla-uF?5’CGCGGATCCATCGATTACATTT3’，Hla-uR5’CGGAATTCTGAGCTGACTATACGTG3’；Hla-dF5’CTACTCGAGGTATATGGCAATCAAC3’，Hla-dR5’CGCGGATCCCCTCTATAGTGTCATG3’；以產腸毒素的野生型菌株基因組DNA為模板，用引物Hla-uF，Hla-uR進行PCR擴增得到與α-溶血毒素基因上游序列同源的基因片段Hla-u；用引物Hla-dF，Hla-dR進行PCR擴增得到與α-溶血毒素基因下游序列同源的基因片段Hla-d；

(2)根據Genbank中公開的已知新霉素抗性基因序列，設計一對引物：上游引物為5’GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3’，下游引物為5’ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA?3’；以載體pcDNA3.1為模板，PCR擴增得到新霉素抗性基因Neor；

(3)基因敲除載體pMHL的構建：將以上步驟(1)和(2)中擴增得到的基因片段Hla-u、Neor、Hla-d進行酶切后連接，得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd，然后將此連接片段克隆入載體pMAD、轉化，經質粒抽提、PCR擴增及酶切鑒定，構建得到基因敲除載體pMHL-α；