技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一類抗凝血物質的蛋白質結構及其制備方法和在防治血栓相關性疾病中的應用。具體而言，本發明涉及抗凝血物質與能被某一凝血因子(包括凝血酶、凝血因子Xa等)識別并裂解的氨基酸序列連接而成的新物質，或抗凝血物質與其它物質通過能被某一凝血因子識別并裂解的氨基酸序列連接而成的新物質，以及這些新物質的醫藥用途。

背景技術

心血管疾病是近年來威脅人類健康和生命的頭號殺手，血栓形成是許多心血管疾病的重要誘因，抗凝劑是防治血栓形成的重要藥物。目前臨床上廣泛應用的抗凝劑主要是肝素，其作用是通過與抗凝血酶III(antithrombin?III)結合來抑制凝血酶(thrombin)的活性，因而可能引起抗凝血酶III的減少，肝素的一個重要缺點是引發血小板減少癥(thrombocytopenia)?，F在又發展的低分子量肝素可以減輕肝素應用中的風險程度，但不能根本克服它的缺點。水蛭素是近年來歐洲已經上市的一個新型抗凝藥物，它是凝血酶的直接抑制劑，但它對凝血酶的強抑制作用，可導致凝血相關參數，如APTT、TT等急劇升高，從而伴有全身或系統性出血風險。

現有抗凝藥物存在的上述問題已經越來越多的受到人們的關注，作為一個理想的抗凝藥物，在全身用藥條件下，應當具有明確的抗凝抗栓效果，但又不引起出血副作用，使臨床用藥安全性提高。

為此，本發明思想的指導原則的關鍵是使抗凝劑活性進行特異性釋放，即在正常條件下，該類物質無抗凝活性，而當凝血系統被激活，有血栓形成可能時，該類物質的抗凝活性才在血栓局部釋放，營造不易形成血栓的微環境(即在可能發生血栓的局部出現抗凝活性)，甚至溶解已形成的微小栓子以達到防治血栓形成的功能。這就克服了肝素、水蛭素等抗凝劑用藥引起系統性出血的風險。

例如水蛭素是由65～66個氨基酸組成的單鏈多肽。其氨基端可以與凝血酶催化活性位點結合，具有抗凝活性，羧基端與凝血酶的底物識別位點結合，對凝血酶有很強的特異性親和作用。本文設計了一個封閉水蛭素氨基末端的措施，以達到降低水蛭素的抗凝活性的目的。當體內凝血系統被激活發生血栓時，利用血栓發生過程中引發的生物化學變化的特點，使氨基末端被封閉的水蛭素重新回復為水蛭素原形，在可能發生或已發生的血栓的局部發揮特異性抗凝作用，從而降低出血副作用，成為一類新型的、安全的、有效的抗凝劑。

在上述發明思想的指導下，本文對水蛭素進行了如下修飾：在水蛭素的氨基末端連接上可被凝血酶或凝血因子Xa識別并裂解的寡肽。該水蛭素衍生物在體內正常情況下不具有抗凝活性，一旦體內凝血系統被激活，則在凝血酶或凝血因子Xa的作用下，釋放水蛭素的抗凝活性，起到抗栓作用。如果在上述水蛭素衍生物的氨基末端再連接上一惰性多肽(如白蛋白)，則可使上述抗凝劑的藥效時間延長，成為一個長效抗凝劑。當然，上述物質對于體內不存在血栓的部位，則無抗凝活性。因此，它不同于水蛭素、肝素等抗凝劑，是一類安全、有效的防栓劑。從而，此類特異抗凝劑對于防治血栓形成的應用具有重要意義。

發明目的

本發明的目的在于提供無抗凝活性而可以防治血栓形成的物質。

發明內容

本發明現已發現，利用凝血酶或凝血因子Xa識別序列連接抗凝血蛋白可實現對抗凝血蛋白抗凝活性的封閉。衍生的抗凝血蛋白具有如下的特征：抗凝血蛋白如水蛭素的氨基末端被凝血酶或凝血因子Xa識別序列封閉后，在體外和血液系統非血栓部位沒有抗凝活性，從而避免或減小了因抗凝血蛋白如水蛭素引起的系統出血的副作用；衍生的抗凝血蛋白只有在血栓發生時，在特有的凝血酶或凝血因子Xa的作用下才釋放出游離的抗凝血蛋白，發揮特異性抗凝活性。本發明基于上述特征的發現現已完成。

因此，本發明第一方面涉及含有被凝血酶或凝血因子Xa識別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白。

本發明再一方面涉及制備含有被凝血酶或凝血因子Xa識別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白的方法，其包括將凝血酶或凝血因子Xa識別序列對應的堿基序列與抗凝血蛋白基因進行連接，另外，將含有被凝血酶或凝血因子Xa識別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白基因上接入惰性多肽的基因，然后這些基因構建至適合表達的載體，如pBV220，pPIC9，pPIC9K等，這些含有目的基因的重組載體在適宜的宿主中表達，例如在大腸桿菌，酵母或動物細胞體系中表達而得到新的抗凝血蛋白。

本發明再一方面涉及含有上述抗凝血蛋白及藥用載體或賦形劑的藥物組合物。