[發明專利]一種金龜子高毒力Bt新菌株、新基因篩選和生物測定方法無效
| 申請號: | 200610144265.4 | 申請日: | 2006-11-30 |
| 公開(公告)號: | CN101190006A | 公開(公告)日: | 2008-06-04 |
| 發明(設計)人: | 馮書亮;王容燕;宋福平;王金耀;張杰;曹偉平;黃大昉;杜立新;宋健 | 申請(專利權)人: | 河北省農林科學院植物保護研究所 |
| 主分類號: | A23K1/18 | 分類號: | A23K1/18;A23K1/00;A01K67/033;C12N1/20;G01N33/00 |
| 代理公司: | 北京路浩知識產權代理有限公司 | 代理人: | 顧筑華 |
| 地址: | 071000河*** | 國省代碼: | 河北;13 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 金龜子 毒力 bt 菌株 基因 篩選 生物 測定 方法 | ||
1.一種金龜子成蟲的飼料,其特征在于,由下列原料組成
干榆葉粉或干花生葉粉20g、瓊脂粉3g、玉米淀粉2g、蔗糖3g、大豆粉10g、酵母粉10g、山梨酸0.5g、Vc?10片、復合Vb5片、等重量的NaCL和KCL組成的鹽0.5g和水300mL。
2.一種金龜子低齡幼蟲的人工飼養方法,包括如下步驟:
1)將金龜子成蟲按雌雄數目1∶1比例置于溫度24~27℃,相對濕度50~70%,光照L13:D11,2000~4000LX的養蟲室中,養蟲籠中土壤相對濕度18~20%,放入金龜子成蟲的人工飼料或天然飼料飼養產卵,天然飼料每日下午更換一次,人工飼料每2天更換一次,每隔2~3天挑取卵1次,其中,所述天然飼料為鮮榆葉;
2)將挑出的卵過40目篩,篩除多余的土,浸入0.2%的次氯酸鈉水溶液中5分鐘,然后用清水沖洗4~5次至無味,吸去多余水份;
3)將土壤在日光下暴曬2天消毒,過20目篩后加水,使含水量為18~20%,接入步驟2)中處理后的卵,在25℃條件下孵化,也可在10~15℃條件下保存30~40d;
4)在養蟲盒中放入5cm的濕土(陽光下消毒2天,含水量18~20%),再放入發芽的玉米和馬鈴薯塊(暗黑金龜幼蟲放入發芽的花生),供幼蟲取食,將每日挑出初孵幼蟲接入飼養盒中,每盒接入初孵幼蟲100頭,再覆蓋3~5cm的濕土,置于25~27℃,條件下飼養10~20天,作為生物測定的供試蟲源;另外,按上述方法在250ml的塑料盒中接入初孵幼蟲5頭進行飼養,每20~30天更換一次新土和自然飼料,當幼蟲生長到2齡未3齡初時,按上述方法分單頭飼養,作為室常年飼養蟲種;
5)飼養至3齡后期時,幼蟲停止取食,體色變黃有皺紋,做蛹室準備化蛹,將已停食的幼蟲單獨飼養,這時可不加食料,并減少換土次數和過多的翻動,以免破壞蛹室影響化蛹,但應每5天打開盒蓋觀察有無成蟲鉆出的痕跡,一旦發現成蟲羽化,及時將羽化的成蟲辨別雌雄后挑入成蟲飼養籠。
3.蘇云金桿菌對金龜子幼蟲的高毒力新菌株、新基因源的篩選方法,包括如下步驟:
生測餌料:①馬鈴薯細絲,選新鮮馬鈴薯塊切成細絲(2mm2粗細),用水沖洗2遍后,控去多余水份;②發芽玉米根,將玉米在水中浸泡12小時,然后撒入濕土中讓其生根發芽,待根長至3cm時挖出,用水沖去泥土備用;③發芽花生,將花生在水中浸泡12小時,然后在保濕的條件下12小時讓其發芽備用(用于暗黑金龜子測定);
稱取馬鈴薯絲40g(或玉米根邊同玉米20粒、發芽花生20粒),加入到40mL濃度為2×107孢子/ml的蘇云金桿菌菌懸液中攪拌混合均勻,連同菌懸液倒入200g土中,放置2h,使土壤含水量為20%;先將生測鉺料均勻分裝于20個養蟲管中,再加入拌勻的菌土,按照優選的生測條件,即采用15日齡銅綠麗金龜幼蟲、5日齡暗黑鰓金龜幼蟲、3日齡華北大黑鰓金龜幼蟲,每管接幼蟲1頭,處理20頭幼蟲,重復3次,在30℃、RH60%的人工氣候箱中感染飼養,土壤使用紫外線照射處理5h的壤土;
調查記載方法:分別于處理后7、14天調查幼蟲的的死亡數量,計算幼蟲死亡率。
4.轉cry8基因植物對金龜幼蟲抗性檢測方法,包括如下步驟:
幼蟲存活率鑒定法
在花盆中種植轉基因煙草或草坪草,種植后15天后待很好地存活后,選擇生長一致的植株進行接蟲試驗,每一花盆接初孵金龜子幼蟲5頭,接蟲后注意保持土壤的濕度,每一處理5盆,重復3次,以不轉基因植株作為對照;接蟲后15天調查幼蟲的存活數量,計算各處理的幼蟲死亡率,明確不同植株的抗蟲效果;
地下部分危害程度與抗蟲性鑒定方法
以煙草為鑒定對象,采用分別種植pSmCN和pBI植株以及混合種植pSmCN、pBI、pTmCN、pTGN和對照山西煙的種植方法,每個處理12株,將轉基因煙草各處理12株分別種植在48×33×13cm的塑料盒子中,土壤深度12cm,每棵煙苗接20日齡的黃褐麗幼蟲5頭或15日齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭,在接蟲15天后,按照分級標準,對各種煙草植株進行統一分級,并計算危害率和危害指數;
地上部分危害程度與抗蟲性鑒定方法
以草坪草為鑒定對象,在48×33×15cm的塑料盒子中加土12cm,隨機種植生長一致的轉基因植株8株和對照植株4株,待植株生長15天后,使植株很好地存活,每穴草坪接20日齡的黃褐麗幼蟲5頭或15日齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭,重復4次,在接蟲15天后,按照分級標準,對各種植株進行統一分級,并計算危害率和危害指數。
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