（一）技術領域

本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達具體地說是以嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus?61家族糖苷水解酶基因61f的畢赤酵母工程菌株Pichia?pastoris?GS-TA-61。

（二）背景技術

糖苷水解酶（英語：Glycoside?hydrolases，又稱糖苷酶）是一種專門水解配糖鍵（glycosidic?bond），并產生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這類蛋白質在人類的產業上也有所應用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。

嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50℃條件下可以產生熱穩定的纖維素酶和61家族糖苷水解酶。

嗜熱子囊菌光孢變種產生的61家族糖苷水解酶61F具有微弱的纖維素酶活性，但對該菌株產生的內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用,可使其活性提高3.89倍。在不同金屬離子如Mn²⁺的作用下，61F和61F+N24的活性可分別提高20倍和1.2倍。

（三）發明內容

本發明從嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus獲得內切β-1,4-葡聚糖酶基因的全長cDNA序列，命名為61f，61f基因cDNA全長1325bp，包括起始密碼子和多聚A尾，具有一個747bp的開放閱讀框，編碼249個氨基酸。具有信號肽序列（1-21aa?MSFSKIIATAGVLASASLVAG）及一個潛在的N糖基化位點（NNS）。

將61f編碼的氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬于糖苷水解酶第61家族，其中3個基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-IPGP具保守性。與絲狀真菌亞西島籃狀菌Talaromyces?stipitatus、馬爾尼菲青霉菌penicilliummarneffei的內切葡聚糖酶的同源性較高，分別達到74%和75%。

構建重組表達質粒載體pPIC9K/61f，利用電轉儀進行電擊轉化pichiapastoris?GS115，在MD和MM培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-TA-61。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28℃200?rpm/min搖床培養6d后，61家族糖苷水解酶的表達量為3.22mg/ml，分子量為29KDa，酶活力為0.0667U/ml，61F在65℃下是穩定的，處理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃處理60min后仍保持67%的活性；75℃的半衰期為40min；80℃處理10min后保持40%的活性；90℃處理50min活性幾乎完全喪失。

61家族糖苷水解酶61F對嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.Levisporus內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力提高3.89倍。不同金屬離子對61F和61F+N24混合酶活性具有促進或抑制作用，其中在Mn²⁺條件下，61F和61+N24的纖維素酶活性可分別提高20倍和1.2倍。

（四）附圖說明：

圖161家族糖苷水解酶61F的SDS-PAGE分析

泳道1：低分子量蛋白標準

泳道2：純化的61家族糖苷水解酶61F

圖261家族糖苷水解酶61F對內切纖維素酶N24活性的促進作用

圖3不同金屬離子對61F纖維素酶活性的影響

圖4不同金屬離子對混合酶的作用

（五）具體實施方式

實施例1：嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus的分離鑒定

（1）標本采集：從堆肥中采集。

（2）分離培養：將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50℃培養3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney?and?Emerson(1964)文獻。

（3）鑒定:參考Cooney?and?Emerson(1964)和LaTouche(1950)文獻。

實施例2：糖苷水解酶基因61g的克隆