技術領域

本發明涉及粳稻云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)及其相關的5對SSR多態性標記，該基因是在對稻瘟病廣譜抗性品種云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)進行精細定位和圖位克隆的基礎上獲得的，與已知的抗性基因Pib相比，含有Pi-y43(t)的云引高抗“四川-43”稻瘟病菌株，而含Pib基因的單基因鑒別系對“四川-43”表現為中抗。?

發明背景?

稻瘟病是由真菌(Magnaporthe?oryzae)引起的廣泛發生在世界各稻區最嚴重的病害之一。每年水稻由于稻瘟病導致的損失，約占總產量的10％～15％，損失達數十億美元。目前控制稻瘟病流行的方式主要是使用農藥進行化學防治和培育抗稻瘟病的水稻新品種。農藥對環境的危害很大，容易造成環境污染，而且增加了水稻種植生產的成本。由于稻瘟病菌生理小種對抗病水稻品種的適應性選擇，導致稻瘟病菌的生理小種發生改變，單個抗性位點的水稻品種往往在種植若干年后即喪失抗性。1981年福建省大面積種植的水稻品種“紅?410”稻瘟病抗性喪失，使當年早季稻瘟病大爆發，失收水稻面積達543.2萬hm²，損失高達數十億公斤的稻谷。一般認為選育廣譜持久抗病且具有多個抗病基因的水稻新品種是解決抗病水稻品種快速感病的有效途徑之一。?

為提高水稻品種的稻瘟病抗性持久性，通過含有不同抗病位點基因的品種間雜交，聚合多個抗病基因，從而獲得廣譜持久抗病的水稻新品種。傳統方法中通過苗期的抗性鑒定很難篩選到含多個抗病基因的株系，包含單一抗性位點的植物具有完全抗性就無法與含有多個抗病基因的植株區分開，結果篩選得到的抗病株系無法區分是否含有多個抗性位點。利用與抗病基因緊密連鎖的分子標記進行輔助篩選，能夠克服依賴于苗期抗性鑒定的不足，該方法已經成功用于稻瘟病抗性多基因的聚合。?

粳稻云引對福建省和四川省兩省的大部分稻瘟病優勢菌株具有較好的抗性，充分挖掘云引中的稻瘟病抗性基因，尋找云引中與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標記，利用傳統育種技術與現代分子生物學技術相結合，通過基因的聚合，導入到其它優良水稻新品種中。?

基于表型鑒定結果的分子標記方法，通過分離群體分析法(BSA)和隱性群體分析法(RCA)，對云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)進行精細定位，為實現這一目標，本發明開發了5對具有良好多態性的SSR分子標記，最終將該基因定位在0.64cM區域范圍。在對目標基因區域進行了基因預測注釋及表達模式分析之后，初步確定了Piy43-3為本研究的唯一候選基因，并通過分段克隆測序拼接法及結合LR-PCR技術對候選基因進行了擴增，克隆獲得Pi-y43(t)。實現了Pi-y43(t)的精細定位，并獲得了與Pi-y43(t)緊密連鎖的分子標記，為分子標記輔助育種奠定基礎。?

發明內容

本發明的目的在于挖掘稻瘟病廣譜抗性品種云引中的稻瘟病抗性基因，尋找云引中與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標記，服務于分子標記輔助育種。?

附圖說明

圖1RM14166在兩親本、抗感基因池及F₂極端感病個性的檢測。P₁：云引；P₂：麗江新團黑谷；Rp：抗病池；Sp：感病池；1-40：極端感病個體；37：重組單株?

圖2Pi-y43(t)基因區域的物理重疊群?

圖3云引稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)遺傳連鎖圖(cM)?

圖4云引稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)物理圖?

圖5Pi-y43(t)目標區域的基因預測?

圖6ACTIN檢測反轉的cDNA質量。M：DL2000；1-4：云引0h、24h、48h、72h樣品；5-8：LTH?0h、24h、48h、72h樣品；9：云引基因組DNA；10：LTH基因組DNA?

圖7Piy43-3?RT-PCR分析。M：標準分子量DL2000；1-4：云引0h、24h、48h、72h樣品；5-8：LTH?0h、24h、48h、72h樣品?

圖8Piy43-3cDNA的擴增。M：DL5000，1為68℃擴增結果?

圖9以云引DNA為模板擴增Pi-y43(t)基因?

圖10注射接種“四川-43”菌株鑒定云引及Pib單基因系。LTH：麗江新團黑谷；Npb：日本晴；YY：云引；IRBLb-B、IRBL14：Pib單基因系?